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项目简介
技术流程
样本要求
结题报告
FAQ
项目简介

1、原理简介  

      ATAC-seq技术由ATAC实验和高通量测序两部分组成,它是分子生物学研究染色质可接近性的技术。该技术在2013年首次被提出,作为MNase-seqFAIRE-seqDNAse-seq的替代或补充方法。ATAC-seq实验的关键部分是转座酶Tn5对样品基因组DNA的作用。

    ATAC-seq采用突变的多活性转座酶,允许高效切割暴露的DNA和同时连接特定序列的接头。分离接头连接的DNA片段,通过PCR扩增后用于高通量测序

1.png


ATAC(Assay for Transposase-Accessible Chromatin)

2.png

  携带着接头(Adapter)的转座酶复合物进入到染色质开放区域,将处于松散状态的DNA片段化同时末端加上接头。特定成对的PCR引物在DNA片段扩增同时末端加上index,经分选纯化后即为可测序文库。

2、技术目标

       ATAC-seq技术检测染色质开放区域,即Tn5酶可接近的DNA区域,将快速又敏感的表观遗传现象可视化。使用具有50,000个细胞的简单两步方案捕获开放的染色质位点。转座子优先并入一般没有核小体(无核小体区域)或暴露DNA段的基因组区域。因此,基因组中某些基因座序列的富集表明该区域不存在核小体,处于DNA结合蛋白等核机器能进入的松散暴露状态,提供有关染色质区段转录活跃状态的信息。

       ATAC-seq实验的测序部分通常将产生数百万个可以成功比对到参考基因组的高通量测序reads。每条reads指向在实验期间发生的一次切割事件在基因组上的位置。然后对比对到参考基因组上的reads进行计数,并创建具有碱基对分辨率的信号峰值(peak)。

  在实验过程中DNA可接近的基因组区域(染色质开放区域)含有更多的测序reads(因为转座酶优先作用于这些位置)。这些开放位点区域可以进一步分为各种调节元件类型:启动子,增强子,绝缘子等。通过进一步的信息整合,如峰与转录起始位点的距离,产生处于开放区域作用下的基因列表;或计算开放区域内的高倾向结合某种特定蛋白的碱基序列(motif),得到活跃基因的上游调控因子,提供全基因组转录因子发生的信息。

       ATAC-seq技术可以进行样本之间差异的染色质开放位点的比较,通常并不单独使用。作为检测表观遗传-染色质开放状态现象的方式,与样本基因表达谱紧密相连,从靶标基因的表观状态关联到表达水平,具有强大的数据挖掘作用。此外,通过关联基因组、外显子,染色质免疫共沉淀(组蛋白修饰或转录因子结合)测序信息,形成:表观调控-基因组-基因表达的完整调控链。

3、技术优势

  采用转座酶法进行DNA片段化,将繁琐的DNA片段化、末端修复和接头连接反应等步骤变为一步简单的酶促反应,将实验耗时缩减到2-3小时。

  实验步骤简化带来的备样时间跨度缩短和失误概率降低,使实验成功率和可重复性大大提升。

  样本需求量从***别甚至***别降低到为50,000个细胞,相较于被替代技术,样本量缩减了至少1000倍,当样本收集困难时更显示出独特的优势。

4、参考文献

1.Wu JY. et al. (2016) The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature.534(7609): 652-657.

2.Greenleaf WJ.et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNDNA-binding proteins and nucleosome position . Nat Methods. 2013 Dec.

技术流程

文库构建策略

文库大小范围为170-750bp

测序策略

采用Hiseq X10 PE150 测序。

实验流程

1) 细胞计数

2) 细胞裂解,转座反应和纯化

3) PCR 反应和纯化

4) 片段选择

5文库检测

6) 上机测序

项目周期

8-24 个样品标准流程的运转周期约为40 个工作日,此周期未包括物料订购周期,定制化产品未备库物流,需提前与交付沟通物料申购。遇样品数较多或较少时,项目周期根据项目规模评估而定。

样本要求

样本要求

样本需求量:每个样本细胞总数200,000 个,稀释于细胞冻存液,分装于冻存管,每管细胞严格控制在50,000 个,总体积不低于1ml

* 建议所送样本细胞活性高,为生长状态良好的新鲜组织或细胞。

* 一次反应的细胞数对于ATAC-seq 实验至关重要,请务必做好细胞计数工作。

细胞样本处理方法

1、收集活性高,生长状态良好的细胞,加入适量配制好的冻存培养液;

2、用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为50,000 /ml

3、转移体积1mL 的细胞悬浮液至冻存管中;

4、把冻存管放到程序降温盒内,再把程序降温盒放到-80℃的冰箱里,盒内温度会成线性下降。保护细胞不被损伤;

5-80℃降温6-24h后,即可准备样本运输。

样本标识

在容器表面写清样品名称,且与信息单上一致。不建议用油性笔直接在管壁或管盖上写样品名称等信息,**将样品名称等各种信息写在标签纸上,贴在管壁,外面再用透明胶带缠绕一圈(防止标签纸没有粘牢脱落,导致样品无法应用)

样本运输

运输过程中需要添加的干冰和冰袋的量与季节、运输时间长短、泡沫盒的薄厚有关(为更有利于保温,尽量选用大块的干冰,建议将样品用透明胶固定于冰袋上,防止干冰挥发导致样品降解)。所有样品尽量保证48 小时内运达。

备注: ATAC-seq 建库一般细胞起始数量范围为:50,000 个细胞,具体起始量与细胞活性及细胞类型相关,细胞数量足够的样本,成功率更高。

细胞活性检测方法参考

台盼蓝染色法

14%台酚蓝母液使用时用PBS 稀释至0.4%,并用0.2um 的滤膜进行过滤处理;

2、细胞悬液与0.4%台酚蓝溶液以9:1 混合混匀。(终浓度0.04%),在三分钟内,

分别计数活细胞和死细胞。

3、细胞活性在70%以上较为理想。若细胞活性率太低,建议进行活细胞筛选。

结题报告

一、背景介绍

二、实验测序流程

1、实验步骤

2、上机测序

三、生物信息分析流程

四、结果展示及说明

1、原始序列数据

2、测序数据质量评估

2.1测序错误率分布检查

2.2碱基含量分布检查

2.3ADAPTER CONTENT分析

2.4测序数据过滤

3ATAC-SEQ数据分析结果展示

3.1项目小结

3.2主要结果展示

3.3ATAC-SEQ数据标准分析结果详解

3.3.1ATAC-SEQ数据参考序列比对(READS MAPPING)结果统计

3.3.2结合位点检测(PEAK CALLING)质量控制

3.3.3PEAKS在全基因组功能性区域上的分布注释

3.3.4回帖序列(MAPPED READS)在基因附近的分布特征分析

3.3.5ATAC-SEQ READS在基因上的分布HEATMAP

3.3.6结合位点(PEAK)进化保守性分析

3.3.7MOTIF分析

3.3.8结合位点关联基因筛选

3.3.9结合位点靶基因GO功能富集分析

3.3.10结合位点靶基因KEGG PATHWAY富集分析

3.4不同组ATAC-SEQ数据差异分析结果

3.4.1差异结合位点识别

3.4.2差异结合位点的MOTIF分析

3.4.3差异结合位点的靶基因分析

3.4.4差异位点靶基因的GO功能富集分析

3.4.5差异位点靶基因的KEGG富集分析

3.5ATAC-SEQRNA-SEQ数据联合分析结果

3.5.1ATAC-SEQ靶基因与RNA-SEQ差异基因分析

3.5.2OVERLAP基因GOKEGG富集分析

FAQ

1、ATAC-seq技术通常与哪些技术结合起来研究?

ATAC-seq获得的是全基因组处于开放状态的序列,这些序列包含了潜在的调控元件,属于表观遗传学的范畴,它通常与RNA-seqChIP-seqHi-C等技术相结合,可以深入研究基因表达的调控机制。

2、ATAC-seq实验样本要求?

ATAC-seq实验的起始细胞量与转座酶的用量需匹配(5万个细胞对应50ul酶切体系),样本量要求:

细胞系:每管5万个细胞,平行准备3管以上;  

动物组织:每管0.1g,平行准备3管以上;

3、ATAC-seq需要生物学重复吗?测多少数据量?周期如何?

至少需要做2个生物学重复,推荐3个重复。我们采用PE150测序策略,每个样本的测序量10G。周期为40个工作日(2个月)。

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