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液体活检

液体活检是指通过微创或无创的方式收集血液或其他体液(包括尿液、腹水、胸腔积液等),并对其中肿瘤相关的物质进行分析的一种检验方式。以血液为例,除了正常的红细胞、白细胞、来自正常细胞的游离 DNA (cell free DNA, cfDNA),还可以检测到一些来自肿瘤的物质,包括循环肿瘤细胞 (Circulating Tumor Cell, CTC)、循环肿瘤 DNA (Circulating Tumor DNA, ctDNA)。需要指出的是,cfDNA 可以来自正常细胞和肿瘤细胞,ctDNA 特指来自肿瘤的游离 DNA。

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cfDNA



图片

cfDNA(cell free DNA)是指细胞游离DNA,通过细胞凋亡、坏死和分泌释放到血液中(图1)。cfDNA通常是双链片段,长度约为150-200个碱基对。ctDNA的分子遗传和表观遗传信息可以反映出起源细胞的基因组或表观基因组。健康成年人的cfDNA浓度一般很低,通常不到每毫升血浆10微克。

在癌症患者中,总cfDNA的某些成分是由肿瘤细胞释放的,称为ctDNA (Circulating Tumor DNA)。ctDNA在整个cfDNA背景中的比例变化很大,从0.05%到90%不等。影响ctDNA浓度的因素很多,包括肿瘤的体积、定位和血运、抗肿瘤治疗(如手术、化疗、放疗等),以及肝和肾的清除作用。据报道,ctDNA的半衰期为16分钟到2.5小时,这使得ctDNA分析可以作为肿瘤情况的“实时快照”。ctDNA在膀胱癌、结直肠癌和卵巢癌等癌症类型中几乎可以100%被检测到,并且在其他大多数癌症类型中也有超过50%的概率可以被检测到,不过在胶质瘤中只有10%的病例中可以检测到ctDNA。同时,血浆中ctDNA浓度和可检测到ctDNA水平也被证明与肿瘤分期有关。

3
cfDNA甲基化


  • 人全谱甲基化测序Methylome-seq, 基于微量DNA甲基化建库技术和液相捕获测序技术, 覆盖 >2M个CpG位点, >25,000个CpG Island约20Mb 区域, 全面覆盖UCSC, Ensembl, ENCODE等数据库关注的重要甲基化位点和基因组元件,例如启动子, CG岛, 增强子等;广泛用于组织及液体活检样本精准检测方案,用于疾病分子分型、biomarker筛选、癌症早筛、MRD检测及复发检测等几乎所有应用场景。

  • 适合所有临床样本类型(石蜡FFPE & cfDNA)

    可实现高深度测序检测 (>100X)

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cfDNA羟甲基化


  • 5hmC化学捕获测序 (Seal-seq)

图片

羟甲基化5hmC是哺乳动物基因组上的第六碱基,在发育、衰老、神经退行性疾病、复杂疾病及肿瘤发生过程中起重要作用;近几年5hmC已经作为一种重要癌症筛查标志物的研究,具有重要的临床价值;5hmC化学捕获测序(5hmC-Seal)通过点击化学、生物素标记捕获等原理,可以超高灵敏度富集羟甲基化信息,降低了DNA输入量的要求, 满足不同样本类型包括血浆cfDNA的全基因组范围羟甲基化检测;广泛用于: 1)发育和疾病甲基化机制研究; 2)复杂疾病与肿瘤分子分型与诊断预后; 3) cfDNA羟甲基化检测、液体活检等临床应用。

  • 样本类型和要求

样本类型

样本要求

血浆/血清/cfDNA

建议提供1-4ml血浆/血清, 或者>15ng   cfDNA

基因组DNA

总量≥ 1ug;   浓度≥ 20ng/ul; 基于Qubit定量

备注:用封口膜密封样品;   干冰运输

在体内cfDNA在血浆里核酸酶的作用下,不断降解消失,

同时新的ctDNAcfDNA进入血浆中,维持一定的动态和半衰期;

抽血离体之后ctDNA会继续降解、含量逐步减少,

而来自白血细胞的cfDNA持续进去血浆,进而稀释ctDNA浓度,降低检测信号。

因此,在采血、血浆分离及保存运输,每一步操作都会影响数据的质量

抽血及暂存注意事项

EDTA抗凝管

2-8度冰箱暂放;在8小时内低温离心分离血浆

Streck等采血管

2-8度冰箱或者常温暂放;在48小时内离心分离血浆

注意:全血样本在分离出血浆之前,千万不要冷冻保存

血浆分离

采取两轮离心分离血浆,4℃条件下以 1600g 离心10min

4℃条件下以 16000g 离心10min

要求EDTA抗凝管采血管需要低温条件离心;

Streck等采血管建议低温离心,也可以常温离心,不受到影响

保存及运输

分离的血浆存放于-80℃冰箱保存(3年内都可以); 使用干冰运输。

cfDNA提取产量

cfDNA的含量存在较大的波动及异质性;

一般正常人及肿瘤早期, 5-15ng/ml血浆;

肿瘤晚期或者化疗等病人, cfDNA浓度显著提高

为了结果的稳定性和一致性,

我们建议使用Streck等采血管替代普通的 EDTA抗凝管,

对于合作项目,免费提供专门的采血管!

引言

一、文库构建和测序流程

1、DNA样品检测

2、文库构建

3、文库质检

4、上机测序

二、生物信息分析流程

三、结果展示及说明

0、项目基本信息

0.1项目名称

0.2样本信息

0.3样本差异比较方案

1、测序数据质量评估

1.1原始数据质量评估

1.2原始数据Trimming

1.3Clean reads质量评估

2、数据比对分析

2.1参考基因组比对情况统计

2.2C位点的测序深度和覆盖度统计

2.3cfDNA文库片段大小统计

3、甲基化位点检测及分析

3.1甲基化位点检测

3.2甲基化水平检测可靠性评估

3.3甲基化C位点比例统计

3.4C位点甲基化水平分布

3.5甲基化位点motif识别

3.6甲基化位点IGV可视化

4、全基因组甲基化图谱

4.1全基因组平均甲基化水平

4.2全基因组甲基化水平分布图(circos)

4.3功能区域甲基化水平分布

4.4基因上下游甲基化水平分布

5、样本间(组间)甲基化水平比较分析

5.1基因组功能元件甲基化水平比较

5.2全基因组甲基化水平相关性分析

5.3全基因组甲基化水平主成分分析(PCA)

5.4全基因组甲基化水平聚类分析

6、差异甲基化分析

6.1差异甲基化区域(DMR)检测

6.2DMR结果注释

6.3DMR长度分布

6.4DMR甲基化水平分布

6.5DMR甲基化水平聚类热图

6.6DMR锚定区域分布

6.7DMR区域IGV可视化

6.8DMR显著性circos图

6.9DMR相关基因GO富集分析

6.10DMR相关基因KEGG富集分析

四、附件

附件1、甲基化测序常见问题

附件2、软件列表

附件3、参考文献

早筛技术路线

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