近日，上海交通大学瑞金医院呼吸与危重症学科瞿介明教授、瑞金医院上海血研所诸江教授，和时任上海公共卫生临床中心的卢洪洲教授等多个研究团队合作，在国家转化医学中心（上海）陈赛娟院士及印彤研究员团队的支持下，在国内**期刊Cell Research （2021 Impact Factor = 25.617）发表研究论文，首次揭示可区分持续无症状（persistently asymptomatic）和潜伏期无症状（presymptomatic）感染者的特异性免疫学特征和蛋白生物标志物。
本研究使用质谱流式细胞分析、单细胞转录组学和Olink血浆蛋白组学等多组学技术手段，对新冠病毒感染静默期（Silent SARS-CoV-2 Infection Stage, SSIS）进行系统性人群队列研究，首次发现了可区分潜伏期和持续无症状感染者的特异性免疫学特征，发现并验证了可用于临床早筛的「潜伏期无症状感染者」蛋白生物标志物STC1和MMP-1，这一发现可以帮助克服核酸检测无法区分上述两种无症状感染者给感染者早期诊疗和疫情防控带来的难题，为对新冠肺炎在临床上更早发现潜伏期无症状感染者，并对其进行及时干预、阻断其进展为确诊患者提供了理论基础和转化契机。
原文：https://www.nature.com/articles/s41422-021-00562-1
笔者感悟：
✦ 「多维度多组学」可助科学家更好地发现免疫学特征；
✦ Olink血浆蛋白组，因其基于免疫学方法，易于跟ELISA等其他临床现有免疫学方法进行互相验证，以加速科研成果的临床转化；
✦对于核酸检测无法区分的病人群体（例如文中的持续无症状感染者和潜伏期无症状感染者），可借助蛋白生物标志物等其他组学工具进行有效区分。
据WHO统计数据显示，全球新冠肺炎确诊病例已超过2.3亿人，死亡病例超过472万人，新冠疫苗接种针剂已达587万。但随着COVID-19病毒的不断进化突变和目前检测仅局限于RT-PCR核酸检测，在新冠病毒感染静默期的人群在无新冠临床症状的情况下无法得到及时区分，导致持续无症状感染者仅在核酸报告阳性转阴性时方可确认为隐形无症状感染者，而潜伏期无症状感染者在进入急性肺炎阶段才能得以确诊并进行临床干预。而流行病学数据进一步显示，静默期的无症状感染者占新冠肺炎的主要传播源，占比75.9%。
Resource from https://covid19.who.int/
新冠病毒感染人体后会产生广谱免疫学反应，而这些正是影响疾病发展进入免疫防御和病症恶化的主要因素。尽管对于急性肺炎阶段已有比较明确的免疫学应答指标以评价疾病进展，如单核细胞和巨噬细胞非正常激活、刺激性紧急骨髓细胞生成和T细胞/B细胞过度激活导致部分免疫功能耗竭等。对于静默期疾病进展早期阶段的免疫应答，目前仍是知之甚少。因此，在本论文中，研究团队致力于发现在静默期起相反决定作用的细胞/分子免疫应答因素，更全面的了解新冠病毒感染后人体免疫系统的特定防御机制和病原传播机制，以发现针对无症感染者更快、更合适的干预及治疗手段。
研究团队对入组的五组人群，包括健康组/隐形感染组/潜伏期感染组/轻症患者/重症患者的临床样品进行了系统的临床队列研究，采用质谱流式细胞技术和单细胞转录组学对患者外周血单核细胞（Periphera Mononuclear Blood Cell，PMBC）进行细胞水平免疫应答研究，同时采用Olink蛋白组学平台对血液样品中的180个蛋白标志物进行分子水平免疫学研究。
研究团队通过临床症状和血清学数据比对分析，发现针对Spike蛋白的IgG和IgM抗体滴度在潜伏期感染人群中升高。质谱流式细胞分析显示，静默期人群中，B细胞激活频率上升；而NK细胞在静默期和急性感染人群中都被频繁激活；同时与持续无症状感染组相比，潜伏期患者的细胞免疫学指标有可见变化（虽无统计学差异），如CD161hi NKT cell (T15)上升；CD62Lhi CD8+ Tnaïve (T04)下降；CD8+ TEMRA上升等。以上细胞免疫学分析数据暗示潜伏期患者在静默期存在T细胞耗竭风险。
通过单细胞转录组学研究进一步发现，单核细胞特异激活和分化发育迟缓，可见于潜伏期感染者，如淋巴细胞中CD44升高和PD-1下降；总单核细胞频率下降，如CD107alo C、MoI-Mo和NC-Mo等。
瑞金医院转化医学国家研究中心（Olink认证合作中心实验室）研究团队在对入组人群血样，采用Olink超多重高灵敏蛋白组学平台，对血浆中的180种蛋白标志物进行了多维度免疫炎症学系统性表征。发现潜伏期感染组血浆中STC1表达水平下降，并伴随单核细胞和淋巴细胞异常。
Olink蛋白组学分析数据进一步发现，在静默期和急性期都有出现和淋巴细胞及骨髓细胞相关的多种免疫炎症指标的可见变化：与正常组相比感染阳性组， T细胞和NK细胞相关的部分趋化因子上升，包括TNFSF14、CCL20、CXCL10和CXCL11；同时，介导单核细胞分化和激活的关键调节因子也有显著上升，包括MCP-1/CCL2、MCP-2、MCP-3 和EN-RAGE。如同预期，抗病毒天然免疫应答相关的细胞因子在静默期和急性期都被检出，包括CASP-8、CCL11、 TRIM5、 IRAK1、CD40、 IL8、 IRF9 和 DDX58，显示人体免疫系统已被激活。
Olink血浆蛋白组学分析数据显示，有7个免疫炎症因子包括4个单核细胞相关因子（MMP-1、CLEC4A、LY75 和 STC1），在持续无症状感染组和潜伏期无症状感染组有明显区别，且与潜伏期感染者单核细胞过度激活相关。在潜伏期感染组，对比健康组MMP-1上升最为显著；对比持续无症状感染组NC-Mo激活及迁移相关的MMP-1阴性调节蛋白STC-1的表达量显著下降；同时，与单核细胞功能相关的DLEC4A和LY75都明显下降。以上研究证据都显示，STC-1在潜伏期人群转急性感染阶段起着重要作用。
多组学队列研究发现两组免疫学特征可区分潜伏期和持续无症状感染者
可能是由于静默期SSIS相关参数之间的干扰，单一技术平台的数据（多重流式细胞、单细胞转录组和血浆蛋白组）都无法通过PCA聚类分析区分潜伏期和持续无症状感染者。研究团队进一步将多组学数据进行整合分析，引入免疫细胞学相关的基因分组后，包括I型INF响应通路中巨噬细胞分化激活相关的6个基因；单核细胞功能及炎症通路相关的10个基因后，在静默期SSIS人群中，有7个血浆蛋白组学生物标志物呈现显著变化，可区分潜伏期和持续无症状感染者。与预期一致，基于基因分组的两个维度，通过PCA聚类分析可发现30个因素组合用于区分潜伏期和持续无症状感染者。以上研究进一步验证了，在复杂疾病机制及临床队列研究中，从多个维度进行多组学研究应用的重要性及必要性。
最后，基于Olink血浆蛋白组学结论，研究团队又进一步通过酶联免疫ELISA技术，对发现的两个重要的单核细胞相关标志物STC1和MMP-1，做了进一步验证。ELISA结果在之前的第1队列研究和全新的第2组队列研究中，都与Olink血浆蛋白学有很好的一致性，STC1和MMP-1标志物可在静默期SSIS中将潜伏期感染者和持续无症状感染人群区分开来。
文中研究团队致力于新冠病毒感染静默期SSIS无症状感染人群，运用「多维度多组学」方法进行系统性人群队列研究，首次发现细胞水平和分子水平特异性免疫学特征，可区分持续无症状感染者和潜伏期无症状感染者；并针对潜伏期感染者在感染静默期的免疫机制进行了系列研究，发现导致静默期SSIS两种相反疾病进展的免疫机制；最后，通过Olink血浆蛋白组和ELISA平台发现并验证STC1和MMP-1两个蛋白标志物可显著区分潜伏期无症状感染者；以上研究数据为对新冠肺炎在更早期进行诊疗提供了理论基础和转化契机。 
