蛋白芯片选择与使用手册蛋白质芯片技术是继基因芯片技术后发展起来的生物检测技术，是蛋白质组学研究中除了酵母双杂交、双向电泳技术、质谱技术等之外的一种重要的工具。蛋白质芯片技术具有平行、快速、自动化的优点，并且检测到的平行数据误差更小，更准确，这对于高通量的研究具有非常重要的意义。它的出现对于生物学、临床检验医学、遗传学、肿瘤学等多学科的进步具有极大的推动作用。蛋白质芯片技术根据芯片上固定的物质不同又分为抗体芯片与蛋白芯片。 近几年来，随着抗体技术的发展，抗体库的建设速度越来越快，生产了大量优质的抗体，从而推动了抗体芯片技术的发展与应用。抗体芯片技术在医学领域的应用，带动了相关科技论文的发表，数量与质量均呈上升趋势。 技术路线
FMB蛋白质标记法技术路线 RayBiotech Sandwich法技术路线 平台介绍 Full Moon Biosystem 美国Full MoonBioSystems公司成立于2001年，专注于蛋白组研究的创新研究，其特色的蛋白芯片产品的所有抗体都通过专利的3-D聚合材料固定在高质量的玻片表面，从而确保抗体芯片产品高度的有效性和特异性。芯片上包含经过验证的抗体、阳性参照、阴性参照等。为了增大数据的可信度，每个抗体都进行了六次重复。 产品特点： 适用于高通量蛋白表达研究； 专利的3-D聚合材料芯片片基，高度特异性，信号强，低背景噪音； 真实样品和比例：组织细胞全部的直接裂解物，无需提纯，非变性； 标准规格的芯片：方便实验和扫描 适用普通芯片扫描仪； 聚焦信号通路：每个芯片集中特定信号传导通路，采用精选的优质抗体； 六次重复，保证数据的稳定性； 大多数芯片同时适用于人、大鼠、小鼠 可检测样品种类多，包括新鲜组织、细胞、血清、血浆、细胞培养上清、各种体液、福尔马林处理组织、石蜡包埋组织均可进行检测。(注意，一般新鲜组织和细胞检出效果**，其他样品可以进行检测，但是需要老师确认的条件下进行。) 产品列表： （具体的抗体目录请登录官网查询或者FMB产品抗体目录excel文件） 信号通路磷酸化水平检测 可逆的蛋白磷酸化反应调节着细胞的大部分功能。蛋白质的可逆磷酸化是细胞中普遍存在的一类酶促共价键化学修饰反应，通过可逆的磷酸化反应，导致蛋白质活性和功能的改变，从而影响和调节着细胞的各种功能，如能量储存、细胞形态变化、蛋白质的合成、基因表达、信号因子的释放、肌肉收缩以及细胞代谢等。 产品列表：
蛋白表达水平检测 产品列表：
RayBiotech 美国RayBiotech公司于2001年正式成立，总部设在美国亚特兰大科技园。是世界上**家专业从事蛋白芯片研发和生产的公司。RayBiotec公司致力于开发、研制、生产及销售以抗体芯片、ELISA/EIA、抗原抗体为主的酶免产品，不仅拥有强大的技术团队，而且十分重视产品的科技创新，公司先后与哈佛大学、普林斯顿大学等国际多家权威科研机构、院校紧密合作，将技术进行广泛应用。世界各国众多科学家使用RayBiotech的抗体芯片等酶免产品已发表数千篇文献 在Nature、NatureMedicine、 Cell、PNAS、Lancet 等世界**期刊上。客户对RayBiotech芯片技术和产品的质量都给予了肯定和很高的评价。以抗体芯片生产为核心，RayBiotech公司将生产线扩大到ELISA/EIA、抗原抗体等数万种产品，涵盖了免疫学领域大多数主要产品种类。经过10余年的发展和品牌积累，RayBiotech已成为国际上公认的蛋白芯片的先驱企业，抗体及酶免产品专家。 产品特点： 灵敏度高，部分抗体检测下限可以达到几个pg/µl； 样品用量少，一张40个因子左右的芯片上样量最少可以低至25-50µl左右血清/血浆/细胞上清，因子数增加，样品对应翻倍。(注意：我们合同中一般要求客户送样至少50-100μl的原始血清或稀释过的血清、血浆或细胞培养物上清，或含20-500μg蛋白的细胞或组织裂解液，是需要考虑得率和备份的情况)； 可以检测的样品种类多，包括新鲜组织、细胞、血清、血浆、细胞培养上清、各种体液均可进行检测。
产品列表： 具体抗体目录见官网或者RayBiotech产品抗体目录PDF文件。 细胞因子相对定量 RayBio®细胞因子相对定量检测抗体芯片技术服务
细胞因子绝对定量 RayBio®细胞因子绝对定量检测抗体芯片技术服务
磷酸化芯片 RayBio® 磷酸化检测抗体芯片
Bio-Rad Bio-Rad公司始创于上世纪60年代，总部设在美国加州，经过40年的不断开拓与发展，公司持续保持健康的年销售增长率和利润率，现在已发展为世界临床诊断和生命科学领域屈指可数的高科技跨国公司之一。Bio-Rad公司的产品主要分布在生命科学和临床诊断两大领域。主要产品包括：各类电泳产品、定量 及定性PCR产品、基因突变分析产品、凝胶成像系统、蛋白质组学研究系统、蛋白纯化平台及各类相关试剂耗材。凭着日益壮大的研究和开发力量，经验丰富的员工队伍，Bio-Rad公司在该领域中，处于技术创新和不断突破的地位。 产品特点： 悬浮芯片系统，96孔板模块，更适用于检测指标少，样品量大的实验设计； 样品用量少，最低可至12µl(注意：我们合同中一般要求客户送样至少50-100μl的原始血清或稀释过的血清、血浆或细胞培养物上清)。 产品目录
样品准备及运输注意事项 细胞 贴壁细胞或悬浮培养细胞，收集约1×107个细胞。常温PBS洗涤3次，低速离心沉淀细胞，弃去PBS（尽量去除干净），放置液氮或-70℃冰箱速冻，干冰运输。 预估细胞数量达到1×107个以上，移出培养箱后尽快去除培养液后用预温的PBS洗涤2次，去除PBS，贴壁细胞直接用RIPA蛋白裂解液或由我们提供的细胞裂解液裂解细胞，10cm的培养皿用量在0.5-0.8ml，6孔板建议每孔使用0.2ml；悬浮细胞收集后直接使用0.2ml裂解液裂解。置冰上或4℃，30min，裂解后完全吸出，-20℃一周内或-70℃保存。 细胞培养液 根据实验目的，细胞培养一段时间后，贴壁细胞直接收集细胞培养上清，悬浮细胞离心去细胞团后收集上清液。为避免细胞培养基中血清的影响，细胞培养上清收集前24hr，**置换为不含血清的培养基。 组织 采集新鲜组织100-200mg，约黄豆粒大小（注意：生物体血液限流后20分钟内取材料并保存好），组织块以PBS或生理盐水清洗干净（尽量洗净血液），切为小块，放入液氮速冻后-70℃保存，干冰运输。 血清和血浆 采集新鲜血液，切忌溶血。全血分离血清，或EDTA抗凝血分离血浆，取100-500ml置-20℃或-70℃冰箱保存，干冰运输。 备注： 本市内细胞样品也可以直接常温运送，运送时在培养瓶中装满培养液并以封口膜封口，然而某些实验条件中包含时间限制，仍建议冻存后运输。 所使用的1.5ml冻存管或离心管、枪头等必须高温灭菌，装好样品后管口需要以封口膜封好。 快递运输所用干冰量至少为8公斤，且运输用泡沫箱需用封箱带密封。 常见问题 抗体芯片的主要应用领域？ 抗体阵列可用于蛋白表达，筛选定性分析，并与正常，病变或治疗后样品的比较 。 哪些类型的样本可用于抗体芯片检测？ 细胞裂解物、组织提取物以及血清、血浆样本都可用于抗体芯片检测分析，福尔马林处理以及石蜡包埋亦可用于检测。 蛋白样品如何进行质检以保证实验质量？ 蛋白实验没有像RNA实验那样有一个2100质检系统，一般会对提取的蛋白浓度进行测定，一般浓度要求达到2-10 g/l。FMB公司所有产品在实验前我们会做一张小的芯片作为预实验，根据预实验结果建议老师是否进行正式实验。 什么是相对定量，什么是绝对定量？ 绝对定量会在杂交样品的同时杂交标准样品用以绘制标准曲线，根据标准曲线求取样品的浓度(g/l)，而相对定量只是比较蛋白在不同的样品间的变化，即A样品是B样品中的多少倍，不绘制标准曲线，也就不能得到准确的浓度。二者没有优劣之分，跟老师的需求以及检测的指标有关。 在什么地方可以找到每一款产品详细的抗体目录，即可以检测哪些指标？ http://www.yunbios.net/h-col-134.html 红色框中的是FMB公司所有产品的目录，包括磷酸化和蛋白表达水平，绿色框中的是RayBiotech和Bio-Rad公司的产品，这两个公司主要产品是专门做细胞因子检测，当然也有部分产品是检测功能蛋白表达的，比如RayBiotech L系列产品，也放置在“细胞因子相对定量检测”中了。都有超链接，可以查找相应的产品。比如，想要查找SET100这款产品，点击“蛋白表达水平”，得到如下图片
所有产品都做了超链接，比如点击SET100，即可得到这款产品的详细目录了，如下图： 有些产品甚至在网页上有通路图，给老师展示起来非常直观。也不用在身上携带任何资料，方便快捷。这块希望大家都能掌握。 FMB公司、RayBiotech公司以及Bio-Rad公司产品各是什么规格？ FMB公司所有产品都是1x的规格，即每张芯片上一个样品； Raybiotech公司产品有多种规格：相对定量芯片一般为4x的规格，即一张大芯片上有四张小芯片，上四个样品，要求客户的样品量为4或者4的倍数，L系列的相对定量产品是2x的规格，即一张大芯片上有两张小芯片，上两个样品，要求客户的样品量为2或者2的倍数；绝对定量芯片是16x的规格，每张芯片能上16个样品(包括标准品)。 Bio-Rad公司的产品为96孔板模块，需要一次性至少做80个样品。 抗体芯片检测是否需要设定对照？ 我们推荐使用抗体芯片检测时同时检测对照样本，包括空白对照、造模对照、阳性对照等。 抗体芯片检测过程中需要的最低蛋白量为多少？ 抗体芯片检测过程中蛋白质需要经过标记与检测两个步骤，需要的最低蛋白量为总蛋白40-100 ug。 如果使用细胞样本，获得100 ug总蛋白需要多少细胞？ 由于细胞类型不同，每个细胞的蛋白含量也不尽相同。我们通常实验中使用 106-107 的细胞可提取大约1mg蛋白质，其中大约100ug 用来进行标记与杂交，因此我们推荐提供 5x106细胞用于抗体芯片检测。 我可以使用除了抗体芯片配套试剂盒中提供的提取缓冲液以外的蛋白裂解试剂吗？ 可以，在细胞或者组织裂解获得蛋白质的过程中是可以使用各种缓冲液的，但是对于FMB公司所有产品和RayBiotech公司L系列产品，这些缓冲液不能包含 Tris等胺类物质。因为 Tris 组分会影响到下一步的蛋白质标记步骤。因此，在使用含有 Tris 组分的缓冲液获得蛋白质之后，推荐使用 Millipore， Microcon YM-10 filters (Catalog: 42406) 或者 Sephadex G-25 columns 置换成标记缓冲液体系。 在裂解过程中需要加入蛋白酶抑制剂吗？ 抗体芯片的配套裂解试剂中是不含蛋白酶抑制剂的。样本取来后，会在低温快速的情况下完成蛋白质提取、标记以及杂交过程。如果您需要自己裂解样本，那么推荐您在蛋白质裂解过程中加入蛋白酶抑制剂。 在抗体列表中经常会有这样的情况 p53(ab-15) 或者 p53(phospho-Ser15) ，应该怎样理解？ 括号中的数字说明这是该蛋白的磷酸化位点位置。 p53(Ab-15) 和 p53(phospho-Ser15) 的区别是这样的，抗体 p53(Ab-15) 是使用围 绕 p53 Serine 15 周围的一段合成的多肽制备的，其中 Serine 15 为非磷酸化状态；而抗体 p53(phospho-Ser15) 也是使用围绕 p53 Serine 15 周围的一段合成的多肽制备的，其中 Serine 15 为磷酸化状态。因此抗体 p53(Ab-15) 只能识别非磷酸化状态 Serine 15 ，而抗体 p53(phospho-Ser15) 可以识别磷酸化状态 Serine 15 ，这一对抗体在芯片上是配对的。 在磷酸化抗体芯片中，为什么往往一个蛋白会有多个抗体对应？ 由于一个蛋白往往具有不同的磷酸化位点，这些位点的不同磷酸化水平又对应不同的功能状态。而我们抗体芯片上的抗体是针 对每个位点特异性的，因此一个蛋白由于具有多个磷酸化位点往往会有多个抗体对应。例如 c-Jun(Phospho-Thr91) 只检测 c-Jun 的 Threonine 91 的磷酸化状态的，而 c-Jun(Phospho-Tyr170) 只检测 c-Jun 的 Tyrosine 170 的磷酸化状态。
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蛋白芯片
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