焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术服务基于QIAGEN公司的PyroMark Q96 ID平台,能提供基于序列测定的SNP检测、等位基因频率分析和甲基化检测,杂合子缺失及细菌和病毒分型等技术服务。
首先通过PCR制备待测序的DNA模板,PCR的引物之一是用生物素标记的。PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育,DNA双链经碱变性分开;纯化得到含生物素标记引物的待测序单链,并和测序引物结合成杂交体。 Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应,四种酶是:DNA聚合酶(DNA polymerase)、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。 测序反应是这样进行的:在每一轮测序反应中,只能加入四种dNTP(dATP S,dTTP,dCTP,dGTP)之一,如该dNTP与模扳配对,聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中并释放焦磷酸基团(PPi)。掺入的 dNTP和释放的焦磷酸是等摩尔数目的.注意:反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATP S)是dATP的替代物,因为DNA聚合酶对dATP S的催化效率比对dATP的催化效率高,且dATP S不是荧光素酶的底物。 硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP,ATP和焦磷酸的摩尔数目是一致的。ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin)的转化,氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个峰的高度(光信号)与反应中掺入的核苷酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解,淬灭光信号,并再生反应体系。然后就可以加入下一种dNTP。 随着以上过程的循环进行,互补DNA链合成,DNA序列由Pyrogram的信号峰确定。 样品要求 · 样品类型 细胞、新鲜组织或DNA样品 · 样品量 细胞样品请提供至少1×106个细胞,组织样品请提供至少100mg的组织块或切片,DNA样品请提供1 μg以上的DNA · 样品质量 基因组DNA无明显降解,主带清晰,大于23Kb,无明显弥散。OD260/280值在1.8~2.0之间,浓度 ≥ 50ng/μl · 样品保存 细胞样品或新鲜组织块(切成~50mg的小块)可液氮冻存后,-80℃保存。DNA样品可溶于乙醇或超纯水中,-80℃保存。样品保存期间避免反复冻融 · 样品运输 样品置于1.5 ml冻存管中,封口膜封好,干冰运输
1 材料 1.1试剂与试剂盒 1.2仪器 2方法 2.1DNA抽提 2.1甲基化修饰 2.2 纯化亚硫酸盐修饰的DNA 2.3 甲基化PCR 2.4 Pyrosequencing检测 |