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当前位置
meRIP-seq m6A检测
SELECT-m6A修饰定量检测
Ribo-seq 翻译组测序
ONT Direct RNA全长转录组测序

m6A是一种常见的RNA甲基化修饰方式,研究表明它在调控基因表达、剪接、RNA 编辑、RNA 稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状RNA翻译等方面扮演重要角色。最新开发微量meRIP-seq技术,通过技术优化,500 ng~20 μg 总RNA即可满足实验要求。利用最新的去rRNA技术,可以同时检测mRNA及lncRNA的甲基化修饰谱,帮助研究人员对RNA转录后甲基化修饰图谱进行全面研究,是表观转录组学研究的关键技术。



技术优势



1. 样本要求低,500 ng~20 μg总RNA即可

2. 同时适用于细胞株和临床样本的检测

3. 全面覆盖mRNA、lncRNA、circRNA的m6A修饰


样本类型



1. 总RNA,500 ng~20 μg

2. 细胞,数量为5x106~107

3. 组织,质量为10~20 mg

**人、大小鼠,其他物种需评估

实测数据

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图1. Peaks结构百分比图


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图2. m6A修饰位点富集于终止密码子区域


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图3. motif分析结果


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图4. 某特定基因的m6A修饰区域


生物信息分析内容

基本分析内容

1、 原始数据过滤及质控
2、参考基因组比对
3、Reads在染色体上的分布
4、Peak Calling 分析
5、Peak 可视化
6、Peak 统计分析
7、m6A 的基本特征
    7.1 peak 在基因元件的分布
    7.2 reads 在基因元件的分布
    7.3 Peak 关联基因的特征
8、差异peak 分析

9、差异peak关联基因GO,KEGG分析
10、motif分析

高级分析内容
11. RNA-seq表达差异与m6A修饰差异关联分析

12. RNA可变剪切与m6A修饰差异关联分析

13. 翻译组RIBO-seq翻译差异与m6A修饰差异关联分析

什么是SELECT?



2018年10月,北京大学化学与分子工程学院贾桂芳课题组在《Angew. Chem. Int. Ed. (德国应用化学)》杂志报道了一种快捷检测RNA中N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)的新方法


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北大贾桂芳课题组发布SELECT技术成果

目前报道的检测方法中只有SCARLET方法能够实现单mRNA和lncRNA中m6A单碱基分辨率的检测,但该方法操作复杂耗时,需要较大剂量的放射性同位素标记,难以广泛应用。北京大学化学学院贾桂芳课题组开发了SELECT方法——single-base elongation-and ligation-based qPCR amplification method,即单碱基延长和连接的qPCR 扩增技术,原理如下图所示:

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SELECT技术原理图

该方法简单快捷,用时只需三小时,能够实现低丰度转录本中m6A单碱基分辨率的检测。该方法基于m6A修饰的两点特性:(i)能够阻碍DNA聚合酶在反转录过程的单碱基延伸;(ii)能够降低缺口连接酶的连接效率。SELECT方法采用荧光定量PCR的方法进行定量。

对比SELECT与meRIP-qPCR



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如何应用SELECT



结合方法优化,SELECT方法有以下3个应用实例:

(i)在生物学样本总RNA或总mRNA中检测mRNA或lncRNA上单位点是否含有m6A修饰;
(ii)检测生物学样本中特定m6A位点的修饰比例;
(iii)鉴定m6A甲基转移酶或去甲基酶的生理作用靶点。

SELECT方法不仅简化了生物学样品中m6A修饰的检测过程,实现低丰度RNA中m6A单碱基分辨率的检测,还能够应用于其他RNA化学修饰的检测中,例如N1-甲基腺嘌呤(N1-methyladenosine,m1A)和2’-O-甲基化修饰(2’-O-methylation,Nm)等。

应用示例:

1. 检测RNA目标位点是否存在m6A修饰;

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qPCR扩增曲线和CT值柱形图显示,HeLa细胞lncRNA MALAT1 (e)以及HEK293T细胞mRNA H1F0(f)的m6A位点和非m6A位点


2. m6A对特定位点的m6A修饰丰度进行绝对定量

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利用系列浓度梯度的已知m6A成分标准品制作标准曲线,然后对特定位点上的m6A修饰成分进行定量


3. 鉴定m6A修饰相关蛋白(甲基化酶、去甲基化酶、识别蛋白等)的作用靶点

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SELECT分析lncRNA MALAT1和以及METTL3+/- 细胞(对照组)的m6A2515 和A2511(input 对照)位点,荧光扩增曲线和qPCR CT 值柱状图显示lncRNA MALAT1 的2515 位点是METTL3 的一个靶点



多款SELECT检测试剂盒以及SELECT检测技术服务,填补市场上特定位点m6A常规检测技术的空白,协助研究者鉴定m6A相关蛋白的作用靶点,深入挖掘m6A修饰的作用机制,有望为RNA m6A修饰分子标志物的发现带来新突破。


真核基因通常产生多种RNA异构体(isoform),可以产生功能上不同的蛋白质变体。传统二代测序实际上是一种短读长RNA-seq,难以获得完整的转录本,无法体现异构体的多样性。

ONT Direct RNA全长转录组测序服务,基于Oxford Nanopore公司的纳米孔测序平台,直接对RNA进行测序,具有长读长的优势,提高对异构体的检测,还能直接检测m6A、m5C等核酸修饰,在可变剪切研究方面具有独特的优势。一次测序,即可满足多项表观遗传转录组研究需求,大大提升研究的高度、深度、准确性、效率,尤其适用于多组学分子机制及珍贵的临床样本研究。

技术应用

1. 对单个RNA分子进行单分子水平的全长测序

2. 识别更长的转录本,研究转录异构体

3. 绘制转录组上的m6A修饰图谱,分辨率可达到单位点

4. 检测RNA可变剪切的情况

技术优势

1. 作为长读长测序技术,能减少短读长测序打断后重新拼接带来的歧义,结果准确度更高、更可信;

2. 能够直接对RNA进行测序,避免逆转录和PCR扩增导致的RNA修饰信息缺失;

3. 可以直接检测m6A等碱基修饰,配合优化的算法,获得无损的m6A单碱基分辨率图谱;

4. 一次测序,多套数据:转录组图谱、m6A修饰图谱、异构体、可变剪切情况,节省珍贵的临床样本,节省样本准备时间和精力,且保持了样本的统一性。

送样要求

总RNA:>20ug

细胞数量:1x107

分析流程

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分析内容

一、isoform分析

1. 可变剪切分析

2. 融合基因鉴定

3. SSR分析

4. LncRNA分析

5. PolyA分析

二、表达定量

1. 转录本定量

2. 转录本差异分析

3. 富集分析

4. 蛋白质互作网络

三、甲基化修饰分析

1. m5C位点注释

2. m6A位点注释

3. 甲基化修饰富集分析

4. m5C差异分析

5. m6A差异分析

四、isoform联合定量表达分析

1. AltTP分析

2. 功能多样性分析(FDA)

3. 差异富集分析

实测数据

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图1. isoform差异热图


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图2. isoform显著差异火山图

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图3. m6A在RNA结构上的分布饼图



案例解读:RNA直接测序应用于鉴定内源转录本异构体的m6A修饰[1]

为了将RNA直接测序应用于单位点分辨率的RNA修饰从头测序,研究员研发了利用纳米孔RNA直接测序的m6A鉴定软件(MINES),对HEK293T细胞转录本进行了分析,鉴定超过13,000个之前未注释的DRACH位点的m6A甲基化状态;还在人乳腺上皮细胞(包括异构体)中鉴定得40,000个位点,这些位点分别对m6A writer、METTL3、eraser、ALKBH5敏感。以上数据表明,纳米孔RNA直接测序鉴定m6A修饰的效果优异。

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纳米孔测序能从DRACH motif中检测出m6A修饰


参考文献

[1] DANIEL A. LORENZ, et al. Direct RNA sequencing enablesm6A detection in endogenous transcript isoforms at base-specific resolution. RNA(2020) 26:19–28.