RNA质检报告，你会看了吗？做RNA-Seq的**步是提取RNA并质检，每当公司将RNA的质检报告交给你的时候，你是不是从来都是略过过程只看结果呢？当“不合格”映入眼帘时，才开始关注图谱和参数，结果呢，参数太多，搞不懂。懂一点的老师仍然是疑问重重，这几个参数都是好的怎么还是不合格呢，这个图谱怎么看呢？为了解除老师们的疑问，下面简单介绍一下RNA质检常用的方法及参数意义。 一、首先介绍一下相关参数的概念 RNA质检参数OD260/OD280、OD260/OD230的意义。 260、280、320、230nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。 A230: 测定其它碳源物质，如酚，糖类等。 A260：核酸的吸收峰，测RNA，DNA，引物等的浓度用的。 A280：蛋白质的吸收峰。 一般的，我们只看OD260/OD280(Ratio，R)在1.8~2.1范围内时，我们认为RNA中蛋白的污染是可以容忍的，不过要注意，当用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R 值可能会大于 2（一般应该是<2.2的）。当R < 1.8时，溶液中蛋白的污染比较明显，可以根据自己的需要决定这份RNA 的命运。当R > 2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。纯RNA的OD260/OD280的比值为2.0。 二、RNA质量检测 RNA样品的品质检测一般分为总量，纯度与完整性三大项。 总量：微量分光光度计测260nm吸收值计算。 纯度：微量分光光度计测260nm/230nm吸收值的比值，用于评估有机溶剂残留；260nm/280nm吸收值的比值，用于评估蛋白质污染比例。 完整性：以AgilentBioanalyzer进行毛细管电泳(capillary electrophoresis)，并以软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估，10为RNA完整性**，0为最差。 一般大于7是可以接受的。 2.1 RNA纯度 RNA在纯化过程中容易受到DNA、蛋白质及有机溶剂的影响，这些残存物将会影响以后的操作。光谱分析(NANODROP)利用物质对不同波长光的吸收度的不同，可以鉴别出溶液纯度及浓度。RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围一般为1.8-2.1。各项实验对RNA纯度要求不一，比如即使比值超出这个范围，RNA样品也一样可以用于一些普通实验中，如Northern杂交、RT-PCR、荧光定量PCR和RNA酶保护等实验。 RNA Purity test: 1. protein contamination OD260/OD280ratio: 1.8-2.1 recommended 2. Organic solventcontamination: OD260/OD230 ratio: > 1.8 recommended OD260/OD270 ratio: > 1.2recommended 2.2 RNA完整性 除纯度以外，RNA的完整性也非常重要。自然界无所不在的RNase使RNA保存相当不易。由于RNase广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNase就会引起RNA在制备与分析过程中的降解。 1）电泳法 2）流式芯片(2100Bioanalyzer) 电泳显示有无基因组DNA污染，有无RNA降解(28S, 18S条带)；通过目测28S和18S条带的比例可以初步评价总RNA的质量。一般认为28S:18S >= 2可以初步判定总RNA完整性较好。跑电泳，RNA应出现清楚的两条Band (28S/18S rRNA)，有时会有第三条band (5S rRNA)，最上方不可出现DNA污染条带，28S/18S应近似两倍。28S和18S核糖体RNA条带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），在加样孔位于图片上方的看图模式下，上面一条带（28S）的密度大约是下面一条带（18S）的2倍。下方还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA等）组成。在28S和18S 核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，此时**需要对总RNA进行纯化。RNA的降解则表现为核糖体RNA带的弥散。上述方法可以清楚分析RNA的完整性，但需样本量过多。流式技术需求量降到25ng，除28S，18S外不应该有其他峰值，28S/18S应该在1.8-2.1之间。 Integrity test by electrophoresis
讲到这里，RNA质检报告应该都会看了吧。 |
