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RNA质检报告,你会看了吗?

做RNA-Seq的**步是提取RNA并质检,每当公司将RNA的质检报告交给你的时候,你是不是从来都是略过过程只看结果呢?当“不合格”映入眼帘时,才开始关注图谱和参数,结果呢,参数太多,搞不懂。懂一点的老师仍然是疑问重重,这几个参数都是好的怎么还是不合格呢,这个图谱怎么看呢?为了解除老师们的疑问,下面简单介绍一下RNA质检常用的方法及参数意义。

      一、首先介绍一下相关参数的概念

      RNA质检参数OD260/OD280、OD260/OD230的意义。

     260、280、320、230nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。

A230: 测定其它碳源物质,如酚,糖类等。

A260:核酸的吸收峰,测RNA,DNA,引物等的浓度用的。

A280:蛋白质的吸收峰。

    一般的,我们只看OD260/OD280(Ratio,R)在1.8~2.1范围内时,我们认为RNA中蛋白的污染是可以容忍的,不过要注意,当用Tris作为缓冲液检测吸光度时,R 值可能会大于 2(一般应该是<2.2的)。当R < 1.8时,溶液中蛋白的污染比较明显,可以根据自己的需要决定这份RNA 的命运。当R > 2.2时,说明RNA已经水解成单核酸了。纯RNA的OD260/OD280的比值为2.0。

    二、RNA质量检测

    RNA样品的品质检测一般分为总量,纯度与完整性三大项。

    总量:微量分光光度计测260nm吸收值计算。

    纯度:微量分光光度计测260nm/230nm吸收值的比值,用于评估有机溶剂残留;260nm/280nm吸收值的比值,用于评估蛋白质污染比例。

   完整性:以AgilentBioanalyzer进行毛细管电泳(capillary electrophoresis),并以软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估,10为RNA完整性**,0为最差。 一般大于7是可以接受的。

     2.1 RNA纯度

     RNA在纯化过程中容易受到DNA、蛋白质及有机溶剂的影响,这些残存物将会影响以后的操作。光谱分析(NANODROP)利用物质对不同波长光的吸收度的不同,可以鉴别出溶液纯度及浓度。RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法,比值范围一般为1.8-2.1。各项实验对RNA纯度要求不一,比如即使比值超出这个范围,RNA样品也一样可以用于一些普通实验中,如Northern杂交、RT-PCR、荧光定量PCR和RNA酶保护等实验。

RNA Purity test:

1. protein contamination OD260/OD280ratio: 1.8-2.1 recommended

2. Organic solventcontamination: OD260/OD230 ratio: > 1.8 recommended

OD260/OD270 ratio: > 1.2recommended

      2.2   RNA完整性

    除纯度以外,RNA的完整性也非常重要。自然界无所不在的RNase使RNA保存相当不易。由于RNase广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNase就会引起RNA在制备与分析过程中的降解。

     1)电泳法

     2)流式芯片(2100Bioanalyzer)

   电泳显示有无基因组DNA污染,有无RNA降解(28S, 18S条带);通过目测28S和18S条带的比例可以初步评价总RNA的质量。一般认为28S:18S >= 2可以初步判定总RNA完整性较好。跑电泳,RNA应出现清楚的两条Band (28S/18S rRNA),有时会有第三条band (5S rRNA),最上方不可出现DNA污染条带,28S/18S应近似两倍。28S和18S核糖体RNA条带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),在加样孔位于图片上方的看图模式下,上面一条带(28S)的密度大约是下面一条带(18S)的2倍。下方还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA等)组成。在28S和18S 核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,此时**需要对总RNA进行纯化。RNA的降解则表现为核糖体RNA带的弥散。上述方法可以清楚分析RNA的完整性,但需样本量过多。流式技术需求量降到25ng,除28S,18S外不应该有其他峰值,28S/18S应该在1.8-2.1之间。

     Integrity test by electrophoresis

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      讲到这里,RNA质检报告应该都会看了吧。


文章分类: 文献解读RNA组学