1 动物组织样本

快速从活体中获取目的组织后，用预冷的 1×PBS 或生理盐水清洗去除血渍和污物，吸干表面液体，并快速将样品分割成 50～100mg 左右的小块液氮速冻（除了保证 RNA 质量外，还要杜绝因环境的改变而导致的表达调控的变化），放入液氮预冷的 RNase-free 的带螺纹旋盖的冻存管中，-80℃低温保存、干冰运输。组织样品离开活体后，建议在 3min 内进行液氮速冻，速冻前操作时间越长，RNA 降解的可能性越大。

如果使用 RNAlater®一类商业组织 RNA 保护试剂保存组织样品，请严格按照相应产品使用说明进行操作。尽量使组织块尺寸保持在 5mm 左右，过小或过大都不利于后续实验操作。

如果使用 TRIzol 裂解液保存送样，请务必先进行液氮研磨破碎，然后加入 TRIzol 中彻底研磨，小于 100mg 组织可加入 1mL TRIzol 裂解。组织样品切勿过量，常温裂解 5min 后，-80℃低温保存，干冰运输。

2 细胞样本

2.1 贴壁细胞

首先去除细胞培养上液，然后用 1×PBS 漂洗 1~2 次，彻底去除 PBS 溶液；用足量的 TRIzol 对细胞进行裂解（一般 10cm2的培养皿均匀铺满细胞需要 1mL TRIzol），裂解过程中用移液器轻轻反复吹吸，如发现裂解液有明显粘丝现象，表示裂解不是很充分，可以适当增加裂解液的用量，最终应为裂解液澄清，没有细胞碎片团块。然后将细胞裂解液转移到 1.5mL 的 EP 管中，室温静置继续裂解 5min 后，转移至-80℃冰箱长期保存。参考用量为每 5×106个细胞加 1mL TRIzol。备注：贴壁细胞切勿使用胰酶消化后收集，以防样本出现降解。

2.2 悬浮细胞

离心收集细胞，然后用 1×PBS 漂洗 1~2 次，彻底去除 PBS 溶液。注意细胞离心收集速度要适度，一般样本 3,000rpm 离心 5min 即可。不要使细胞离心过实而造成裂解液不能充分渗透，转数过高还会导致细胞破裂，RNA 降解。再用充足量 TRIzol 对细胞进行裂解（方法同 2.3.1 贴壁细胞处理）。裂解在 TRIzol 中的样品，短期保存于-20℃冰箱中（1 周内），如长期保存可转移至-80℃冰箱。参考用量为每 1×106个细胞加 1mL TRIzol。也可离心收集细胞后直接液氮速冻后，转移至-80℃低温长期保存，干冰运输。

2.3 血液样本

用于提取Total RNA的血液，强烈建议使用血液保护剂送样或分离白细胞后送样。常规的EDTA抗凝管收集的全血不太适合用于RNA的研究。推荐使用 BD PAXgene blood tube 保存。PAXgene®血液RNA管内含稳定体内基因转录性状的添加剂，它是通过减少体外RNA降解并将基因诱导减少到最小而发挥作用的。操作流程如下：

2.3.1 PAXgene 血液采集

PAXgene 系统提供标准化的 BD Vacutainer（真空采血管，室温保存），配合使用一次性消毒采血针作静脉穿刺，采血管内的负压会迫使血液自动吸入管中，当搜集的血液达到 2.5 毫升刻度线时停止采血。采血管中本身已经预装了 6.9 毫升的 RNA 稳定试剂，拔出针头后只要将采血管轻轻颠倒 8-10 次将二者混匀即可。如图 1 所示：

图 1 PAXgene 采血示意图

将 PAXgene®血液 RNA 管竖直置于室温（18°C 到 25°C）下平衡，最短 2 小时，最长 72 小时，之后转移至 4°C 过夜，最后置于-80°C 保存，干冰运输。

2.3.2 哺乳动物白细胞的分离方法

使用 EDTA 抗凝管收集的全血样本应立即加入 3 倍体积红细胞裂解液，室温放置 5min，期间颠倒混匀数次。1,500g，离心 5min，弃上清。再加入 1mL 红细胞裂解液重悬沉淀，1,500g，离心 5min，TRIzol 裂解（一般起始量 2mL 全血的沉淀，加 1mL TRIzol）。用移液器反复吹打至看不到细胞团块，溶液呈澄清而不粘稠的状态。放入-80℃冰箱中长期保存，干冰运输。

2.4 血浆样本

取出血液样本，1,600g，4℃离心 10min。离心后血液分为三层，上层的是血浆，中间的是白细胞层，下层的是红细胞层，用移液器吸取血浆至冻存管中。在分离血浆时取至白细胞层以上 3-4mm 处为宜。血浆中含有游离核酸，为去除残余细胞中核酸对游离核酸的干扰，应将血浆进行二次离心。将血浆在 4℃条件下以 16,000g 离心 10 分钟。血浆根据后续的实验要求进行分装，每管样本量为单次实验所需的量为宜，如 300-500μL/管。-80℃冰箱保存，干冰运输。

注意事项：

a) 推荐 EDTA 抗凝处理，尽量避免肝素抗凝血，已有研究报道认为高浓度肝素对后续酶学反应有抑制作用，可能会造成检测失败。

b)分离血浆的过程尽量在冰上操作，以维持血细胞的完整性。

c)整个分离操作应在 4 小时内完成。

2.5 血清样本

血清，指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋原白已被除去的血浆。为使血液完全凝固，将收集管室温（15-25℃）静置 10min 至 1h。若收集管中有促凝血剂，则凝血时间为 10min。若未加促凝血剂，凝血时间至少为 30min。1,600g，4℃离心10min。小心转移上层血清层至新的离心管。16,000g，4℃离心 10min。小心转移澄清的上清液，冻存于-80℃冰箱备用，干冰运输。

2.6 石蜡包埋样本

至少提供 10 片以上 10μm 厚度的切片或者提供包埋的蜡块。切取石蜡时，如果标本暴露空气中，弃去最初的 2-3 片，切片完成后尽量选取切片中组织含量高的部分，如果石蜡过多可切去石蜡部分。如果需要再从切片上剥离特定区域的组织（如肿瘤），除了提供白片之外，还需要提供 HE 染色的片子，并在 HE 片子上圈出特定区域。

2.7 RNA

客户需提供 NanoDrop®、 Qubit® 或 Agilent 2100® 的样本分析结果：请仔细纯化样品，尽量避免多糖、蛋白质和外切酶的残留，样本必需注明溶剂成分。