1.1 SMART-seq

2012 年，由美国和瑞典的科学家共同开发了称为 Smart-Seq（Switching mechanism at 5’end of the RNA transcript）的技术 。在 2013 年，Nature Methods 杂志上报告了新的方案，被称为 Smart-Seq2，随后在 2014 年他们有公布了详细的操作流程 。获取单细胞并裂解细胞后，含有 oligo-dT 的引物与 mRNA 的 poly- A 结合，逆转录酶 MMLV 进行逆转录，逆转录酶到达 mRNA 5’末端时，MMLV 的末端转移酶活性会在一链 cDNA 的 3'末端增加额外的胞嘧啶，这时 TSO 引物 3' 末端的 rGrG+ G 结合到**链末端的胞嘧啶，然后以**链 cDNA 为模版进行延伸合成互补的第二链，全长 cDNA 经过 PCR 扩增后进一步进行测序文库的构建。

SMART-seq2 技术原理

技术优势

• 前期个性化取样指导

• 实验周期短，28天

• 样晶类型多样化

• 多种建库策略：全长和3端

• 灵活的收费标准

样本要求

1. 按照裂解液使用说明配制 2 x 裂解液。将配制好的裂解液用无菌滤芯枪头加入 1.5 ml 低吸附离心管中，每管 5 ul，避免产生气泡。如果有气泡，请离心去除。

2. 分选的单/寡量细胞转移至裂解液中，确保加入到裂解液中的溶液总体积小于 5 ul。

3. 立即涡旋震荡裂解细胞，充分混匀后快速离心。

4. 液氮速冻，转移至-80℃冰箱短暂保存。

5. 用封口膜将离心管封口，放入 50 ml 离心管中（干冰上操作）（此步骤是防止运送过程中 1.5 ml 离心管破裂），埋于干冰中寄送，转移过程中避免反复冻融。

1.2 10X Genomics

2016年2月，10x genomic公司推出Single Cell Gene Expression Solution平台，可对高通量的数字基因表达的复杂细胞群进行深入分析，生命科学研究进入了单细胞生物学时代。

10 x Chromium Single Cell Gene Expression Solution

原理

基于10x genomics平台，利用微流控技术进行单个细胞分选，将带有条形码和引物的凝胶珠和单个细胞包裹在油滴中；在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA；液体油层破坏后，cDNA后续进行文库构建，使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据，10min内自动完成多至80,000个细胞的捕获，从而达到在单细胞水平进行表达测序的目的。

10 x Chromium Single Cell Gene Expression Solution技术原理

技术优势

与其他高通量捕获平台相比，一次实验可完成多至80,000个细胞的捕获，通量最高，周期快速，成本最低；细胞捕获效率高，单个样本细胞捕获率高达65%；商业化仪器操作简便。

应用方向

10 x Chromium Single Cell Gene Expression Solution能有效地解决组织样本无法破解的细胞异质性难题，有助于发现新的细胞类型；基于大量的单细胞基因表达数据，该平台还可进行细胞表达特征聚类、亚群表达特征、标志物筛选等方面的分析，是一种高效的细胞基因表达水平的检测技术，在发育与生殖、免疫、干细胞分化、肿瘤异质性、神经系统发育以及脑发育等研究领域中有着广泛的应用和研究结果发表。

样本要求

· 细胞数量与浓度：细胞起始数量大于1x105；浓度 5x105-1.2x106 /ml；

· 细胞活性：活细胞数量在90%以上；

· 细胞大小：细胞直径小于40 μm；

· 组织需要解离成单细胞悬液；

· 植物细胞需要制成原生质体；

· 细胞培养基及缓冲液不能含有Ca2+和Mg2+等影响酶活性的物质。

1.3 BD Rhapsody

BD公司推出的这款Rhapsod™单细胞分析系统采用了分子标签技术，能为单细胞中每个转录本标记特异性分子标签，实现单细胞水平上基因表达谱的绝对定量。同时，每个细胞也会被标记特异性细胞标签，使得高通量平行建库成为可能。结合Rhapsody特有的单细胞分离技术，单次实验可制备100-10000个单细胞文库，用户可根据需求定制引物，将检测范围集中在目标基因，大幅降低后续测序成本。

BD Rhapsod™单细胞分析系统

技术优势

• 超高通量:每个通道可容纳5000~10000个细胞核
• 超强捕获：细胞核捕获率高达65%
• 适用广泛：适用于细胞系、原代细胞、新鲜和冻存样本的研究
• 精细分析：可对单细胞基因调控网络进行精细化分析

• 研究细胞异质性
• 探索生物标志物
• 定义细胞类型
• 构建基因调控网络

• 肿瘤微环境
• 自身免疫性疾病
• 感染性疾病
• 器官、骨髓移植
• 抗体开发

●   类型：

        新鲜组织，原代细胞，细胞系等。

●   来源：

        血液提取、磁珠富集、流式富集、组织解离等。