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1

单细胞RNA测序

1.1 SMART-seq

2012 年,由美国和瑞典的科学家共同开发了称为 Smart-Seq(Switching mechanism at 5’end of the RNA transcript)的技术 。在 2013 年,Nature Methods 杂志上报告了新的方案,被称为 Smart-Seq2,随后在 2014 年他们有公布了详细的操作流程 。获取单细胞并裂解细胞后,含有 oligo-dT 的引物与 mRNA 的 poly- A 结合,逆转录酶 MMLV 进行逆转录,逆转录酶到达 mRNA 5’末端时,MMLV 的末端转移酶活性会在一链 cDNA 的 3'末端增加额外的胞嘧啶,这时 TSO 引物 3' 末端的 rGrG+ G 结合到**链末端的胞嘧啶,然后以**链 cDNA 为模版进行延伸合成互补的第二链,全长 cDNA 经过 PCR 扩增后进一步进行测序文库的构建。

SMART-seq2 技术原理

技术优势

  • 前期个性化取样指导

  • 实验周期短,28天

  • 样晶类型多样化

  • 多种建库策略:全长和3端

  • 灵活的收费标准

样本要求

  1. 按照裂解液使用说明配制 2 x 裂解液。将配制好的裂解液用无菌滤芯枪头加入 1.5 ml 低吸附离心管中,每管 5 ul,避免产生气泡。如果有气泡,请离心去除。

  2. 分选的单/寡量细胞转移至裂解液中,确保加入到裂解液中的溶液总体积小于 5 ul。

  3. 立即涡旋震荡裂解细胞,充分混匀后快速离心。

  4. 液氮速冻,转移至-80℃冰箱短暂保存。

  5. 用封口膜将离心管封口,放入 50 ml 离心管中(干冰上操作)(此步骤是防止运送过程中 1.5 ml 离心管破裂),埋于干冰中寄送,转移过程中避免反复冻融。

1.2 10X Genomics

2016年2月,10x genomic公司推出Single Cell Gene Expression Solution平台,可对高通量的数字基因表达的复杂细胞群进行深入分析,生命科学研究进入了单细胞生物学时代。

10 x Chromium Single Cell Gene Expression Solution

原理

于10x genomics平台,利用微流控技术进行单个细胞分选,将带有条形码和引物的凝胶珠和单个细胞包裹在油滴中;在每个油滴内,凝胶珠溶解,细胞裂解释放mRNA,通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA;液体油层破坏后,cDNA后续进行文库构建,使用Illumina测序平台对文库进行测序检测,即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据,10min内自动完成多至80,000个细胞的捕获,从而达到在单细胞水平进行表达测序的目的。

10 x Chromium Single Cell Gene Expression Solution技术原理

技术优势

与其他高通量捕获平台相比,一次实验可完成多至80,000个细胞的捕获,通量最高,周期快速,成本最低;细胞捕获效率高,单个样本细胞捕获率高达65%;商业化仪器操作简便。

应用方向

10 x Chromium Single Cell Gene Expression Solution能有效地解决组织样本无法破解的细胞异质性难题,有助于发现新的细胞类型;基于大量的单细胞基因表达数据,该平台还可进行细胞表达特征聚类、亚群表达特征、标志物筛选等方面的分析,是一种高效的细胞基因表达水平的检测技术,在发育与生殖、免疫、干细胞分化、肿瘤异质性、神经系统发育以及脑发育等研究领域中有着广泛的应用和研究结果发表。

样本要求

· 细胞数量与浓度:细胞起始数量大于1x105;浓度 5x105-1.2x106 /ml;

· 细胞活性:活细胞数量在90%以上;

· 细胞大小:细胞直径小于40 μm;

· 组织需要解离成单细胞悬液;

· 植物细胞需要制成原生质体;

· 细胞培养基及缓冲液不能含有Ca2+和Mg2+等影响酶活性的物质。

1.3 BD Rhapsody

BD公司推出的这款Rhapsod™单细胞分析系统采用了分子标签技术,能为单细胞中每个转录本标记特异性分子标签,实现单细胞水平上基因表达谱的绝对定量。同时,每个细胞也会被标记特异性细胞标签,使得高通量平行建库成为可能。结合Rhapsody特有的单细胞分离技术,单次实验可制备100-10000个单细胞文库,用户可根据需求定制引物,将检测范围集中在目标基因,大幅降低后续测序成本

BD Rhapsod™单细胞分析系统

技术优势

1.对细胞悬液的宽容度高。10X Genomics要求80%的细胞活率让不少小伙伴愁掉头发,BD Rhapsody应对50%细胞活率的样本仍游刃有余,细胞碎片和红细胞对其稳定性的影响也非常有限,非常适合处理难度高的临床样本。
2.配套扫描仪,单细胞捕获情况做到心中有数!比起10X Genomics只能盲做到cDNA才能质检,BD配套开发的BD Rhapsody™ 扫描仪可以有效帮助实验人员观察每一步操作时微孔板中的状态,随时决定是否终止实验。将细胞铺到微孔板中,可以观察细胞分布,细胞活率和状态;将beads铺到微孔板中,可以观察beads是否进入了大多数微孔中;裂解细胞后用磁铁把beads回收后可以观察beads是否回收完全。
3.反转录的磁珠超长稳定存储!逆转录后,抓着cDNA的beads可以在4℃存放3个月之久,还可以反复使用,完全不必担心建库失败。
4.细胞捕获率高达80%,远超市面上其他单细胞平台
5.细胞捕获通量范围广,100-40,000 cells/微孔板。
6.兼容CITE-seq和cell hashing。AbSeq kit可以同时进行单细胞蛋白和转录组联合检测,也可以利用cell hashing提高样品通量,最多可以同时handle12个样本。
7.针对临床应用,靶向定制panel。选定特定基因组合进行建库测序,直击重心,避免管家基因占据通量,节省测序和分析成本。
2
单细胞核RNA测序
技术优势
1、高质量抽核:抽核经验丰富,针对不同组织优化了解决方案;
2、标准化内控:丰富的实操经验构建了标准化的内控体系;
3、流程化分析:完善的分析流程,准确快速解析单细胞核转录组数据;
4、专业化团队:资深的技术团队具有多年项目方案设计、实验操作、售后分析等经验;
5、全流程服务:提供组织抽核、单细胞核捕获、反转录、建库测序及数据分析的全套服务。
应用方向
冷冻样本;通过消化难拿到高质量的单细胞悬液的组织类型。
样本要求
1、组织用量:黄豆粒大小 1 块;
2、样本处理:组织液氮速冻,-80℃保存;
3、质量要求:组织 RNA 无降解,RIN≥7;
4、运输方式:干冰运输。
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单细胞ATAC测序
技术优势
  • 超高通量:每个通道可容纳5000~10000个细胞核
  • 超强捕获:细胞核捕获率高达65%
  • 适用广泛:适用于细胞系、原代细胞、新鲜和冻存样本的研究
  • 精细分析:可对单细胞基因调控网络进行精细化分析
应用方向
  • 研究细胞异质性
  • 探索生物标志物
  • 定义细胞类型
  • 构建基因调控网络
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单细胞TCR/BCR测序
技术优势
●通量高
一张芯片具有 8 个独立的通道,可供 8 个样本同时上机,每个通道最高可捕获 10000 个细胞。
● 分辨率高
可获得真正单细胞水平的的免疫组库信息,并且可匹配 TCR/BCR 的双链。
●信息全面
可同时获得单个细胞匹配的 mRNA 和 TCR/BCR 信息。
应用方向
  • 肿瘤微环境
  • 自身免疫性疾病
  • 感染性疾病
  • 器官、骨髓移植
  • 抗体开发
样本要求

●   类型:

        新鲜组织,原代细胞,细胞系等。

●   来源:

        血液提取、磁珠富集、流式富集、组织解离等。

应用领域:

1、肿瘤研究:从单细胞角度了解肿瘤异质性、肿瘤和免疫微环境、生物标志物发现和疗法开发背后的复杂生物学机制,从而解决癌症相关问题。
2、免疫治疗:通过单细胞多组学鉴定来重新定义免疫学,并获得传染病、疗法开发、过敏和炎症、自身免疫性疾病以及移植的可行性见解。
3、神经科学:从全新的角度认识神经复杂性,以单细胞分辨率深入了解精神疾病、神经退行性疾病和发育神经生物学。
4、发育研究:器官发育研究需要数十万到数百万细胞,涵盖不同发育时间,不同发育部位的组织样本,才能探索全面的细胞类型信息,发现发育过程的稀有细胞,绘制完整的细胞发育轨迹。
5、药物筛查:一次实验可分析近百万细胞,大幅度提升了稀有细胞检出效率。大规模药物筛选会涉及到几十甚至上百个样本,高通量解决方案可满足几十个样本同时上机的需求,帮助筛选用药类型及用药时间,指导用药,降低成本。
6、图谱研究:器官图谱研究需要几十万甚至上百万细胞才能探索更加完整的细胞类型,实现细胞类型的精细分群,发现稀有细胞类型。


2022-06-10
海洋生物样本的单细胞测序理论上可以做,但成功率一直很低,因为海洋生物细胞的多种特性制约了单细胞测序实验的正常进行。通过比较目前***的两个商业化单细胞研究平台BD Rhapsody和10X Genomics,我们的结论是BD Rhapsody平台更适合进行海洋生物单细胞测序的研究。01BD平台开展海洋生物单细胞研究的优势盐离子浓度、金属离子浓度以及其它干扰物质10x Genomics平台是将...
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