Quantitative analysis of proteomics

定量蛋白质组学是一种用来检测样品中蛋白相对/绝对含量的分析化学技术，而质谱则是实现该技术依赖的一个重要手段。基于质谱的蛋白质组学主要分为两大类，即标记定量和非标记定量。其中，标记定量常用的是iTRAQ和TMT两种试剂盒，其均是利用质谱检测报告离子的信号相应强度来对蛋白进行相对定量的。而非标记定量的原理则是对被检测到的离子峰强度进行积分，以积分面积进行相对定量的。近几年备受关注的数据非依赖采集（Data Independent Acquisition）方式则是传统非标记定量的升级版，能够扫描到更全面地碎片信息，不会造成低丰度蛋白的丢失。

产品介绍

The service content

——iTRAQ 同位素标记定量技术

iTRAQ同位素标记定量技术

iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）技术是由美国应用生物系统公司AB研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用4种或8种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量。

实验原理

iTRAQTM试剂在结构上包括3个化学基团，分别是报告基团、平衡基团和反应基团。（如下图1）

图1：4plex iTRAQ分子结构。

不同样品的同一肽段经iTRAQ试剂标记后具有相同的质量数，并在一级质谱检测（MS1）中表现为同一个质谱峰。当此质谱峰被选定进行碎裂后，在二级质谱检测（MS2）中，不同的报告基团被释放，它们各自的质谱峰的信号强弱，代表着来源于不同样品的该肽段及其所对应的蛋白的表达量的高低。

iTRAQ技术的特点

1、通量高

2、重复性好

3、灵敏度高

4、定量准确

5、数据丰富

6、自动化程度高

优势

1、蛋白提取、浓度测定、蛋白酶切一站式服务

2、强大的项目团队：拥有研究员、博士、高级外聘专家等数名

3、技术成熟：近10年的组学技术服务经验，拥有完善的样品处理体系

4、先进的仪器设备   

应用领域

疾病标志物筛选　　　　植物抗逆研究

发病机理研究　　　　　药物靶点研究

特殊功能蛋白质筛选       作用机制研究

植物品种改良              　工程菌改造   

实验流程

注：以iTRAQ 8标为例

样本类型及含量要求

送样要求

仪器设备

Thermo Q-Exactive高分辨质谱   

Sciex Triple TOF 6600质谱仪

服务流程

① iTRAQ / TMT 定量蛋白质组和双向电泳技术相比，有什么优势？

双向电泳技术是伴随着 MALDI-TOF 技术发展起来的蛋白质分离技术，理论上可以通过等电点（IEF）和分子量（SDS-PAGE）的差异将总蛋白质逐一分开。但实际情况并不理想，因为低丰度蛋白无法染色成功而看不见，蛋白翻译后修饰后偏离理论位置等等，一张 2-D胶能鉴定到的蛋白质总数最多 1000 - 2000 蛋白。相较于2-D以及 DIGE 等基于电泳的技术，iTRAQ / TMT 分辨率高，细胞样品最多有发现超过 6000 个蛋白，并且绝大多数蛋白都有定量和定性信息；其次 iTRAQ/TMT 通量高，可以一次最多完成 8 或10个不同处理组的实验，特别适合于多组样品间的同时比较以及生物学过程的动态检测。

② iTRAQ / TMT 实验的主要步骤有哪些，主要采用哪些仪器，检索的软件及常用数据库有哪些？

实验步骤包括：蛋白提取、浓度测定及 SDS-PAGE 凝胶检测，质检报告；蛋白酶解、标记；一维色谱分离，冻干机冻干；高分辨 LC-MS/MS 质谱检测；搜库定性、定量分析；差异蛋白筛选，差异蛋白生物信息学分析；完整报告整理。目前质谱仪器有：Sciex公司 6600 Triple TOF、Thermo 公司Q Exactive、Fusion质谱仪。常用的检索软件有：SCIEX公司ProteinPilot 5.0、Thermo 公司Proteome Discoverer。常用的数据库有：Uniprot数据库、NCBI数据库、本地自建数据库。

③iTRAQ、TMT、Label free 实验用的是什么质谱仪，其定量是基于一级质谱还是二级质谱？

iTRAQ、TMT、Label free都属于蛋白组学实验，前二者是属于同位素标记定量蛋白组二者的原理都一样；第三个是非标记定量蛋白组。 三者所用的仪器都差不多，主要有：Sciex公司 5600 Triple TOF、Thermo 公司Q Exactive； PS: TMT 10标蛋白组只能用thermo公司Q Exactive，不能用AB 5600 做。 Itraq、TMT是基于二级质谱定量，Label free是基于一级质谱定量。

TMT同位素标记定量技术

       TMT（tandem mass tags）是由Thermo公司开发的一种体外标记技术，广泛用于差异表达蛋白质分析研究中。该技术采用多重同位素标签与肽段的氨基发生共价结合反应，可实现同时对不同样品中蛋白质的定性和定量分析（目前最多可实现同时标记16个样本）。

实验原理

     如下图所示，TMT试剂在结构上包括3个化学基团，分别是报告基团、平衡基团和反应基团。反应基团特异与肽段的氨基发生共价结合反应，将TMT试剂连接到肽段上。在一级图谱中，不同样品来源于同一个蛋白质的同一个肽段由于被连接上总质量相同的完整TMT试剂而表现为一个峰。但在碰撞室内，平衡基团会发生中性丢失，而报告基团则会产生相应的报告离子（六标为126、127、128、129、130和131 Da，十标为126、127N、127C、128N、128C、129N、129C、130N、130C和131 Da，十六标为126、127N、127C、128N、128C、129N、129C、130N、130C、131N、131C、132N、132C、133N、133C、134N）。这些报告离子的强度就代表了相应样品蛋白质/肽段的强度，实现了对6个/10个/16个不同样品的同时定量。

TMT技术特点

1、通量高：可一次性分析6、10、16个样品。

2、重复性好：所有样品的分离鉴定条件一致。

3、数据丰富：   可获得所有蛋白的定性和定量信息。

4、自动化程度高：以高分辨率液质联用为基础，自动化操作，分析速度快。

5、定量准确：减少了样本处理、以及不同组上机造成的实验误差，因此能达到定量更准确的效果。

6、灵敏度高：可检测到表达丰度为皮克（pg)级的蛋白，无高丰度蛋白样本（血液、脑脊液、肌肉组织、骨组织等）可检测。

DIA技术

数据非依赖采集（data independent acquisition，DIA）是近年来备受瞩目的质谱采集技术之一，一度引领了定量蛋白质组学新发展。

DIA相比于DDA的**的优势在于高效测定复杂样品中丰度极低的蛋白分子，极大地提高了定量分析的可信度。其原理是在质谱数据采集时，高速、循环的将每个采集窗口内的所有母离子及其子离子碎裂后进行全扫描，而非根据母离子信号强度筛选后进行二级碎片再扫描。因此DIA具有高通量、高分辨率、高可重现性、定量准确等优点，而且样本无需分级上机，极大的缩短了每个样品的检测时间，适合大样本量的蛋白质组研究。但由于DIA获得的是几乎没有任何丢失的所有离子信息，数据量及其复杂性大大增加，数据分析难度加大。目前主流的数据分析是基于 DDA/DIA 构建的谱库和实验产生的 数据对样品中的蛋白质进行鉴定和定量。公共的谱库可以从各大蛋白质组研究数据平台下载，但对于一些特异性的样本，为了有更好的鉴定结果，还需要通过实验样本建立DDA参考数据库。

提取的蛋白酶解之后，利用液质联用技术对肽段进行质谱分析，通过比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。每条肽段的丰度（量）与其在质谱中的峰面积或信号强度成正比；而不同样品的同一条肽段在LC上的保留时间（retention time， RT）是一致的，因此，可以通过对比谱图库中的信息，再整合到相应蛋白，实现对蛋白质在不同样本中的相对表达水平的定量分析。

（1）重现性好：采集所有离子及碎片谱图，不丢失任何信息；

（2）选择性好：基于碎片离子（即母子离子对）定量，与 SRM/MRM 相当；

（3）准确度高：循环时间固定，扫描点数均匀，定量准确度高；

（4）通量高：同时监测所有目标蛋白/ 化合物，通量无上限；

（5）时效性强：对于易降解样品可以即刻采集，获得数据后再深入挖掘；

（6）数据易追溯：即使目前的水平无法发现某些蛋白/化合物，未来可以回溯

临床疾病标志物的筛选

作用机制研究

药物作用靶点研究

疾病的分子分型

磷酸化靶点研究

癌症血清标志物的筛选与验证

DIA技术:先利用常规DDA质谱检测技术分析建立图谱库，之后采用DIA方法进行质谱数据采集，从而实现对样品中蛋白质的定性及定量，不同于传统的DDA技术，DIA技术将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，因此可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息，数据利用度大大提高，缺失值更少。因此，DIA技术更适合于大样本量、复杂体系的蛋白检测。

PRM技术：平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring) 是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术，能够对目标蛋白质、目标肽段（如发生翻译后修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/肽段进行相对或绝对定量。PRM技术是基于质谱的靶向验证蛋白组学技术，完美的替代了基于抗体的Western blot、ELISA等。PRM技术运用平行反应监测技术特异性地选择与预先设定质荷比相同的肽段离子并进行定量，可以有效排除干扰离子，提高蛋白质的定量准确性。

技术的特点

DIA技术是基于质谱的新一代蛋白组学技术，DIA技术采用数据非依赖性采集扫描模式，摆脱了传统DDA（代表性技术：iTRAQ/TMT）扫描的偏好性制约，可以无遗漏地获得样本中所有离子的碎片信息，以达到样本数据的完整性。

DIA技术较传统的iTRAQ/TMT/Labelfree蛋白组技术而言，具有如下优势：

1. 保证了数据的完整性，缺失值少。

2. 克服了iTRAQ/TMT的通量低的限制。

3. 提高了低丰度蛋白的检出率。

4. 基于Thermo公司的QE-HF高端质谱，检出率提升20%以上。

DIA实验流程

PRM实验流程

基于Thermo公司的QE-HF高端质谱，检出率提升20%以上。