GeoMx DSP技术平台将蛋白质组的多重定量信息与组织原位信息进行整合，可在一张石蜡组织切片上实现多达上百种蛋白质的原位共分析。不同于多重免疫组化（mIHC）和多重免疫荧光技术（MultiplexedImmunofluorescence, mIF），DSP技术通过核酸探针偶联的抗体对靶蛋白质进行原位捕获，再通过特殊的光解离释放核酸探针，并运用nCounter数字标签技术实现计数定量，从而直接反映出靶蛋白质的丰度。DSP采用对抗体偶联核酸实现定量，完全消除了传统多重分析中光谱交叠的影响，大大提高了可测靶点的通量，且通过nCounter独有的分子标签技术进行计数定量，无需核酸扩增等一系列酶促反应，大大提高了数据的保真性和准确性。

1. GeoMx DSP数字化空间蛋白质组技术优势

1.1将组织病理学、肿瘤免疫与蛋白质表达谱完美结合，在肿瘤微环境研究、肿瘤异质性与肿瘤免疫研究中有着强大的优势；

1.2可在一张石蜡组织切片上实现多达上百种蛋白质的原位共分析；

1.3除了免疫细胞图谱核心Panel，还可以搭配多种不同的模块 （Modules）来满足不同的研究需求；

1.4可以额外提供多达10个定制靶标满足个性化开发需求；

1.5通过nCounter独有的分子标签技术进行计数定量，提高了数据的保真性和准确性。

2. 研究流程

2.1   DSP蛋白质检测技术流程

待测目的蛋白质的抗体通过 UV（紫外光） 可切割接头（Linker）共价连接到含有DNA Barcode（DNA条形码）的寡核苷酸链上。通过将荧光直标的形态学标志物（Morphology Markers）与这些抗体同时进行孵育，再通过UV光解将感兴趣的区域（Region of Interest, ROI）的寡核酸链收集起来，经过与下游nCounter检测探针等试剂进行杂交，再利用NanoString nCounter系统进行数字量化，最后将数据返回到DSP进行分析，实现这些离散ROI内详细表达谱的信号解读。（具体见图一）

图一 GeoMx DSP的简单技术流程

(1) 染色

FFPE切片使用标准流程进行抗原修复，然后与荧光成像试剂（形态学标志物的抗体，Morphology Markers）以及与偶联了DNA Barcode的待测目的蛋白质的抗体混合物进行孵育。

(2) ROI选择

DSP可支持多达4通道荧光的20倍图像。由形态学标志物染色成像建立组织的整体结构（例如，PanCK ：上皮来源细胞的形态学标志物，例如：肿瘤细胞；SYTO-13 ：细胞核染料和 CD45 ：免疫细胞的形态学标志物）。基于形态学标志物的成像信息圈选 ROI以进行多重分析。

(3) 局部寡核苷酸释放

对选定的 ROI 进行紫外光照射释放寡核苷酸链。

(4) 寡核苷酸收集

通过微毛细管（吸样针）收集已释放到载玻片上方水性液体中的光裂解寡核苷酸，并放入 96 孔板中用于后续定量。针对不同的 ROI 进行局部紫外光照射和寡核苷酸收集（步骤 （3）-（5）），并在每个循环之间进行大量清洗。

(5) 定量

与NanoString的荧光条形码检测探针等杂交，使用标准NanoString nCounter分析系统量化，使每个ROI能够对高达约100万个结合事件进行数字计数。

(6) 数据生成和分析

nCounter读数返回DSP后将被处理成数字计数并映射回每个ROI，生成组织结构内的蛋白质图谱。蛋白质的表达矩阵将进行下游数据质控和分析。

2.2   蛋白质组信息分析流程

DSP数据分析是一个基于服务端的交互式分析系统，根据研究目的不同，开展以用户为主导的个性化分析。数据分析基本流程如下图所示：

2.3   蛋白质组信息分析内容

DSP数据分析软件可对数据进行处理和统计分析，并导出热图、箱线图、柱状图等适于文章发表的结果呈现形式，可以很精确地分析不同区域中的蛋白质表达谱。通过不同质控的设定，包括管家基因（HK）以及IgG对照，来实现实验流程各个环节的把控。

2.3.1 标准分析

1．数据QC质控和过滤

2．数据标准化处理

3．蛋白质表达谱总览

4．PCA主成分分析

5．样本AOI/ROI表达相关性分析

6．蛋白质Marker表达相关性分析

7．蛋白质差异表达分析

8．肿瘤免疫微环境细胞富集分析

9．肿瘤免疫微环境细胞差异分析

2.3.2 定制化分析

可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析服务内容。

2.3.3 分析结果示意图

所有分组蛋白质表达热图

PCA降维

蛋白质相关性分析

差异蛋白质火山图

TME细胞丰度箱线图

数字化空间蛋白质组检测产品

产品服务列表

Core和Modules的信息

产品服务流程

项目周期

标准流程从样本接收质控合格到数据交付（包括样品HE质控时间），运转周期约为 2个月（40 个工作日）， 每批次96AOIs以上需额外增加时长，选择个性化信息分析条目需额外评估项目周期。

交付指标和售后服务

1. 根据合同规定完成分析。

2. 提交项目结题报告文档，说明项目完成情况。

3. 分析过程中产生的项目结题报告、下机原始数据以及相关生物信息分析结果文件。如果数据量小于 100G，使用阿里云提供；因网络等原因无法顺利下载的，可提供移动硬盘传输；如果数据量大于 100G，所有数据将会使用移动硬盘传输。

4. 数据交付后 6 个月内，提供免费的项目咨询服务。

5. 最终数据提供后，可继续保留数据 3 个月，如需延长数据保存时间需做费用评估。

产品服务优势

常见问题FAQs

Q1. 什么样品类型适合使用GeoMx DSP技术进行空间信息分析？

DSP 技术可以用于各种组织类型: 包括正电荷粘附载玻片固定的 (+ charged slides mounted) 石蜡包埋组织 (FFPE) 切片和新鲜冻存(FF)组织切片。 在 NanoString 总部的 TAP (Technical Access Program) 服务项目中， 已经在DSP上成功验证过 55 种以上的各类肿瘤组织， 如下图所示： 包括肿瘤组织、 穿刺样品、 骨髓和皮肤等各类组织。 DSP 也兼容各类样品类型，包括石蜡切片、 冷冻组织、 组织芯片和细胞培养切片等。具体可执行样本类型，请咨询当地业务负责人。

Q2. 对于使用 nCounter 技术作为 GeoMx DSP 空间分析下游定量技术的项目，分析过程中是否有PCR扩增？

对于 DSP蛋白质检测的下游 Oligo 标签（含有 DNA Barcode的寡核苷酸链）定量步骤，如果采用 nCounter 平台的话，不需要反转录或 PCR 扩增步骤和建库过程，可以直接用 nCounter 平台对 Oligo 标签进行定量，无需建库过程。nCounter技术对于Oligo标签或RNA分析的定量原理如下图所示，通过杂交两段探针：Capture Probe和Reporter Probe，检测 Reporter probe 的荧光信号组合来实现对 Oligo 标签的直接单分子定量分析。一个检测到的荧光Reporter probe对应一个Oligo标签分子或RNA分子，可以实现无扩增直接单分子定量。

Q3. GeoMx DSP 技术可以同时检测 Protein 和 RNA 吗？

通常情况下，DSP 可以在组织切片上检测 Protein 和 RNA，但需要两张相邻的组织切片，一张切片做 RNA，另一张切片做 Protein. 两张切片使用同样的 Morphology （Imaging） Markers，同样的组织微环境高度可比，后续可以整合 Protein 和 RNA 表达数据。

Q4. GeoMx DSP 蛋白质检测技术是否可以进行单细胞分析？需要选择的最少的细胞数目是多少？

DSP 蛋白质检测技术的目的是用来高分辨率解析复杂组织微环境中的不同细胞组成， 以及这些细胞亚群中不超过96 种蛋白质的空间原位表达谱。DSP技术本身具有在单个细胞水平上选择 ROIs 的分辨率，关于ROI 范围大小的问题，因为nCounter技术本身没有任何的PCR扩增步骤，我们需要在每一个ROI中收集到足够多的Oligo 标签来进行准确的96 种蛋白质的表达谱分析，因此，每个ROI中的最少细胞数其实和研究者要在空间中回答的生物学问题有直接关系。DSP 技术可以捕捉到单细胞水平的ROIs，如果使用 nCounter 技术定量，我们通常会推荐最少10-50个细胞的 ROI 大小做蛋白质检测。如果使用 NGS 技术定量，会引入 PCR 扩增步骤建库加入NGS Adaptor序列，需要的ROI大小可以比 nCounter 技术推荐的小一些。

Q5. 比起组织显微切割细胞进行空间检测，GeoMx DSP 有什么优势吗？

组织显微切割，用户需要将感兴趣的组织亚细胞群或区域切除收集，并经过复杂的自行优化或其他商业平台进行下游的RNA提取，反转录，扩增到最后的测序文库制备，然后进行RNA表达谱分析。这个过程首先会损坏组织切片，其次这个复杂的试验流程会引入各种偏差，并且成功率和数据重现性会是一个很大的挑战。DSP平台的推出，目的就是为了简化上述的复杂的流程，在不破坏珍贵样品组织切片的情况下，可以很容易的精准的用紫外光照射选取ROI，并进行下游的Protein和RNA的表达谱分析，组织切片可以重复利用来分析未收集过Oligo标签的其他ROIs, 也可以把DSP用过的切片样品用作其他蛋白质或核酸的检测。更重要的是，DSP 作为一个商业平台，高度整合了自动化的实验流程，大大简化手动步骤，确保了数据的准确性和高重复性，并推出经过了大量验证后的专注于多个领域的蛋白质 和RNA检测 Panels，能够直接被研究者用在免疫学、肿瘤免疫、和神经科学的研究中，再配合DSP平台的全套的数据整合和分析软件环境，能够帮助用户快速搭建自己的，从样品到分析结果的，多重空间蛋白质组和转录组的分析平台。