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项目简介
样本要求
应用案例

RRBS最高性价比甲基化检测方案

简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS),

通过酶切富集启动子及CpG 岛区域,并进行Bisulfite 测序;

作为最高性价比的甲基化研究方法,RRBS在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用;

在经典RRBS基础上,艾斯基因在国内首家推出强化版 RRBS,助力全基因组甲基化测序,

可覆盖全基因组范围内超过6-9M个CpG 位点,>90%数量的CpG岛及>85%数量的基因启动子。

核心技术质控,用心服务每一个项目

专注表观组学10年,提供专业有价值的DNA甲基化完整解决方案;

最早开发RRBS技术团队之一, 国内首家推出强化版RRBS服务;

已经完成人、哺乳动物及鱼类等多个物种, 10000+例样本项目经验;

严格的RRBS技术质控,MSPI酶切率>95%, Bisulfite转化率>99%;

自动化样本处理、建库及分析流程,保障高效周期,40天极速交付;

低至10ng建库,满足穿刺、流式分选、微切等微量珍贵样本的研究;

核心团队在Nature、Epigenetics、DNA Res等杂志发表多篇SCI论文;

专业的生物信息分析团队, 提供更多个性化分析思路和方案。

科学方案设计

从项目方案、样本处理、建库测序,到数据分析;

每个项目需要专业、有价值的建议;及时高效的沟通,以保障高质量研究成果。

样本类型和要求

样本类型

样本要求

基因组DNA

总量≥ 1ug; 浓度≥ 30ng/ul; 完整性好; 基于Qubit定量

细胞、全血、动物新鲜冷冻组织

按照送样要求准备

备注1:不推荐FFPE、cfDNA等片段化样本类型;

备注2:不适合植物物种;

备注2用封口膜密封样品; 干冰运输

数据分析

RRBS

分析内容

备注

标准分析

1、测序数据质量评估

过滤掉低质量数据,保证数据质量

2、与参考基因组比对

比对率和覆盖度分析

3、MSPI酶切及Bisulfite转化率质控

MSPI酶切效率>95%; Bisulfite转化率>99%

4、甲基化位点Calling

评估胞嘧啶甲基化状态

5、甲基化分布图谱分析

甲基化在基因组、功能元件上的分布

6、组间差异甲基化DMR分析

寻找DMR及注释

7、差异甲基化基因DMG分析

DMG富集分析GO,KEGG

8、多样本聚类分析

PCA分析多样本甲基化变化规律

高级分析

9、多组学整合关联分析

例如与转录组关联分析

10、其它定制化分析

结合课题背景亮点挖掘


一、   送样类型

基因组 DNA、细胞、全血、动物组织二、 保存方式

基因组 DNA、细胞、全血、动物组织:放-20℃冰箱中保存,或者放-80℃冰箱中长期保存(1年以内);保存期间避免反复冻融。

三、   运输条件

1、基因组 DNA:冰袋或者干冰运输(推荐干冰运输);  

2、细胞、全血、组织样本:干冰运输,顺丰陆运(3-4天时间),夏季10-15公斤干冰;秋冬季10公斤干冰;

四、   样本量要求

1、基因组DNA:常规 RRBS,总量不少于 1ug,浓度不低于 25ng/ul;

1)提供样本 DNA完整性质检结果,例如琼脂糖凝胶电泳或者Agilent2100电泳等;

2)提取基因组 DNA,要加 RNA酶,去除 RNA污染;

3)提取基因组 DNA,溶到 TE 或者 elutionbuffer, 避免溶解到纯水;

4)提供 Qubit检测浓度,基于OD值的检测方法,例如 NanoDrop, 会严重高估浓度。

2、细胞样本:常规 RRBS,不少于 2x10*6个细胞;  

1)收集贴壁或者悬浮细胞、使用预冷的 1×PBS,洗涤 2次,600g离心 5分钟;  

2)最后一次离心后,尽量去除上清 PBS,保留细胞沉淀;

3、全血样本:1-5ml外周血  

1)使用普通 EDTA抗凝管,避免使用肝素抗凝管。

4、动物组织: 30mg以上

用预冷的 1×PBS   溶液洗掉组织表面残留的血液;取不少于 30mg(绿豆大小)组织块,放置-20℃冰箱中保存,或者放-80℃冰箱中长期保存(1年以内)。

案例分析1:DNA甲基化异常用于甲状腺结节诊断

Identification of Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics. Clin Cancer Res. 2019;15;25(2):544-551

1、研究方案:恶性结节和良性结节常常难以诊断,本课题通过RRBS检测了109个甲状腺组织的DNA甲基化,发现癌旁、良性结节和癌组织之间存在显著差异,并在65个甲状腺结节的回顾性队列样本中得到验证。

2、研究结果:这些组织特异性DMR与活性增强子和癌症相关基因密切相关,表明DNA甲基化为甲状腺结节提供准确的诊断。并开发及验证了基于靶向甲基化测序TBS (Targeted Bisulfite Sequencing) 用于甲基化多位点甲状腺结节诊断的转化应用方案的重要价值。


案例分析2:癌前病变到浸润性肺腺癌DNA甲基组的演变

Evolution of DNA methylome from precancerous lesions to invasive lung adenocarcinomas. Nat Commun. 2021 Jan 29;12(1):687.

研究背景:在肺腺癌的早期癌变过程中,DNA甲基化谱和甲基化肿瘤内异质性(ITH)的演变尚未得到系统的研究。

研究方案:本课题通过RRBS方案对124个手术切除样本(14个非典型腺瘤性增生AAH; 15 个原位腺癌AIS; 22个微侵袭性腺癌MIA和11个侵袭性腺癌ADC及病灶旁样本)进行单碱基分辨率的甲基化测序。

研究结果:

1、在晚期病变中甲基化变异逐渐增加,甲基化水平明显升高;

2、从甲基化变异推断的系统发育模式类似于基于体细胞突变的模式,表明DNA甲基化和体细胞突变的演化是平行的;

3、在晚期疾病中T调节细胞(Tregs)与CD8+T细胞的比率较高,这意味着随着肿瘤进展免疫抑制;

4、此外,全局低甲基化增加与更高的突变负担、拷贝数变异负担和更高的Treg/CD8比率相关,表明DNA甲基化在肺腺癌早期癌变过程中对染色体不稳定性、突变和肿瘤免疫微环境的潜在影响。


案例分析3:产后发育过程中肠道菌群暴露驱动肠道上皮细胞的甲基化组及转录组变化

Exposure to the gut microbiota drives distinct methylome and transcriptome changes in intestinal epithelial cells during postnatal development. Genome Medicine. (2018) 10:27.

研究方案:肠道菌群在肠道发育中起重要作用,研究者收集1周、4周、12-16周龄(代表婴儿期、青少年期、成年期)的正常及无菌小鼠的小肠肠道上皮细胞(IEC),进行RRBS和RNA-seq测序,每组5个重复;

研究结果:研究发现细菌对转录组的影响随时间增加,而大多数菌群依赖性的DNA甲基化差异在出生后早期即出现,并鉴定出126个基因位点的DNA甲基化及RNA转录与菌群相关,通过靶向甲基化测序TBS (Deep Target Bisulfite Sequencing) 和RTqPCR在另外一组独立样本(10个/组)中加以验证。


案例分析4:发育基因的表观突变是养殖欧洲鲈鱼开始驯化的基础

Epimutations in developmental genes underlie the onset of domestication in farmed European sea bass. Mol Biol Evol. 2019 May 30.

研究方案:本研究通过RRBS测序,比较了早期驯化的(n=12)与野生的(n=12) 欧洲鲈鱼在驯化过程中DNA甲基化变化。

研究结果:发现早期驯化的鲈鱼与野生的没有遗传差异,但在不同胚胎起源的组织中发生DNA甲基化变化。这些甲基化突变与经过25年选择性育种后的胞嘧啶至胸腺嘧啶多态性显著重叠,表观突变基因与正选择基因一致。结果表明驯化初始阶的表观变异是一个重要事件。