一、 样本组设计要求
项目的样本组设计、样本处理条件等对于检测结果会有影响，对于发表文章的科学意义也至关重要。
我们参照文章审稿常见的问题，请您对样本进行以下的核实：
样本冻存之前，已经确保离心除去细胞 （细胞冷冻破裂会影响外泌体纯度）；
样本保存后，未经过反复冻融，各样本冻融次数一致；
每个样本的处理条件一致，无显著系统误差：
o 样本采集后，等待处理的时间、保存温度、运输方式和距离一致；
o 样本处理步骤一致：如离心时间、温度和速度；尽量是同样的实验员；
o 血浆：抗凝方法一致；
o 血清：制备条件参数较多，请确保完全一致；
样本包括了适当的对照组；
样本组和对照组的处理条件一致性；
样本组和对照组的入组和排除标准：
o 样本组和对照组：年龄、性别、地域分布一致；
o 更严格地，样本组和对照组饮食习惯、BMI、饮酒、吸烟等习惯分布一致；
o 其他重要疾病的存在情况是否一致。
二、 样本类型、送样体积、建议的处理条件
1. 血浆或血清
· 由送样单位采集血液，分离血浆或血清后-80度冷冻，干冰箱寄送；
· 样本类型：
可检测血浆或血清样本；同一项目中制备方式保持一致。
血浆制备可以采用任何一种抗凝管
· 检测用量：
o 如需要超离提取，样本建议为每例3 ml；
o 如需SEC或超滤法提取，样本需求为每例0.5 ml；
o 如选择体液直接捕获，样本需求为每例0.1 ml；（支持96孔板送样，建议使用0.2ml孔板，以耐-80度低温铝膜贴紧，每孔样本体积0.1 ml。）
· 血浆分离步骤：
1. 取血样，置于4度冷藏或冰上, 60分钟内按以下2步离心处理；
2. **步离心制备血浆：低速离心， 离心15分钟，2000 g，取上层血浆，切勿吸出白膜层及红细胞沉淀。若出现溶血，应弃用；
3. 第二步离心去除其他沉淀：低速离心， 离心15分钟，10000 g，去除沉淀，取上清液；
4. 取上层清液于新的离心管中 (最多装至管的三分之二体积，以防冷冻后溢出)
5. 标记：送样管上有清晰标记，送样单上记录对应信息。
6. 于-80度保存。
· 血清分离步骤：
1. 按照实验室SOP促凝血并离心制备血清；若出现溶血，应弃用；
2. 第二步离心去除其他沉淀：低速离心， 离心15分钟，10000 g，去除沉淀，取上清液；
3. 取上层清液于新的离心管中 (最多装至管的三分之二体积，以防冷冻后溢出)
4. 标记：送样管上有清晰标记，送样单上记录对应信息。
5. 于-80度保存。
2. 其他体液（尿液、脑脊液、骨髓液、体内积液、唾液、痰液、泪液）
· 检测用量：
o 若需要外泌体提取，样本需求为每例尿样 > 10 ml，唾液> 3 ml，脑脊液 > 1 ml，骨髓液> 1 ml，体内积液 > 3 ml，痰液> 1 ml。
o 若无需提取，样本需求为体液样本每例0.5 ml。
· 分离步骤：
1. 取体液，置于合适的离心管中，置于4度冷藏或冰上, 60分钟内按以下2步离心处理。若体液粘稠，如痰液、唾液，请加入PBS稀释后进行离心去除细胞。
2. **步离心：低速离心， 离心15分钟，2000 g，取上清液，若血液混入体液，请备注；若血液混入后出现溶血，应弃用；
3. 第二步离心：低速离心， 离心15分钟，10000 g，去除沉淀，取上清液；
4. 取上层清液于新的离心管中 (装至最多三分之二体积)，切勿吸出沉淀。
5. 标记：送样管上有清晰标记，送样单上记录对应信息。
6. 于-80度保存。
3. 细胞培养液等低浓度EV悬液
· 适用样本：
细胞培养液、关节冲洗液、泪液收集、组织消化后上清液等样本的EV提取产物均可检测。
· 细胞系培养EV检测注意事项：
o 请提供恰当的对照样本，如该细胞系的同批次的新鲜培养液；
o 尽量使用去外泌体牛血清exosome-depleted FBS (dExo-FBS)培养细胞。
· 分离步骤：
1. **步离心：低速离心， 离心15分钟，2000 g，取上清液，沉淀应弃用；
2. 第二步离心：低速离心， 离心15分钟，10000 g，取上清液，沉淀应弃用；
3. 取上层清液于新的离心管中 (装至最多三分之二体积)，切勿吸出沉淀。
4. 标记：送样管上有清晰标记，送样单上记录对应信息。
5. 于-80度保存。
4.已提纯的EV样本
· 适用样本：
EV提取产物均可检测。
· 注意事项：
o 外泌体提纯产物以PBS重悬；
o 高浓度提纯EV，送样体积大于30μl，粒子浓度大于1010/ml。
o SEC产物直接送样，无需浓缩，对应至少50ul血浆或500ul尿液的提取产物
o 送样管上有清晰标记，送样单上记录对应信息。
o 于-80度保存，且样本冷冻于底部，无分散液滴。
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