MBS(mapping-by-sequencing)

       MBS是针对有参考基因组的物种，利用混合分组分析（BSA , bulk segregant analysis）结合全基因组重测序，测序数据比对到参考基因组，将鉴别到的分子标记与性状进行共分离分析，对锁定到的目标区间内的基因进行功能注释，实现性状决定基因的快速定位。

特点

● 与传统的图位克隆相比，耗时短、成本低、定位更准确

● 根据每个客户的研究目标和内容灵活定制研究方案

● 提供标准和高级生物信息分析，可根据客户需求提供个性化数据分析

● 已成功完成拟南芥、水稻等多个物种突变体定位项目

推荐测序模式

● Hiseq4000, PE150

● ≥30 X基因组大小

样品要求

● DNA：≥1 μg

● OD260/280为1.8-2.0

● 适用范围：
· 单倍体、二倍体或多倍体物种（有参考基因组） ·家系群体（F2、DH、RIL等皆可）
· 子代混池规模：质量性状≥50个个体；数量性状≥30个体且不超过总群体10%比例

数据分析内容

常见问题

● 1. MBS(mapping-by-sequencing)混池需要混多少个个体？
质量性状建议50个以上，数量性状建议30个以上。为了缩小定位的区间，混池中的个体越多越好，前提是个体的表型判别尽可能准确。另外，对于数量性状，注意单侧极端池个体占总群体比例不超过10%。

● 2. 野生型亲本是否也需要进行测序？是否也需要混池？
在分析过程中，需要进行背景噪声的扣除，因此一般都需要提供野生型亲本的基因型数据。如果能提供构建群体的直接亲本，则无需混池；对于无法明确直接亲本的项目，需要对直接亲本世代相近、覆盖整个亲本基因库的多个个体进行混池。

● 3. 显性性状能否采用MBS(mapping-by-sequencing)来做，如何取材？
可以做，一般要同时对F2代中3:1分离的两种表型分别混池测序，且分离比为3的株系我们建议通过F3代的表型分离来确定F2代的基因型，在这里选取F2代基因型为纯合系的株系测序。

案例展示

案例一：质量性状定位——水稻突变体基因的快速定位

研究背景：

        2011年，地震和海啸导致日本大面积的稻田被海水污染，日本地方水稻品种Hitomebore口感优良、产量高、但不具备耐盐性，无法适应骤然上升的高盐环境，急需培育Hitomebore的耐盐品种。如果采用传统育种需要至少10年时间。

研究内容：

　　本文对EMS诱变的Hitomebore突变品系进行筛选，获得一个耐盐的突变株hst1，对hst1和野生型Hitomebore杂交构建F2分离群体。基于MBS的策略，对F2代中具有耐盐性的20株个体混池与野生型亲本同时进行基因组重测序，通过Mutmap分析方法鉴别到发生非同义突变的基因OsRR22，并通过等位基因突变体的杂交试验确认该基因是控制水稻耐盐性状的关键基因。以hst1为基础，通过与Hitomebore株系杂交，仅用两年的时间培育出了水稻耐盐品种Kaijin，该品种既有突变体hst1的高耐盐性，又保留了Hitomebore株系的优良性状。

● 1. EMS诱变筛选耐盐突变体

对野生型Hitomebore株系进行EMS诱变，从6000株突变体中筛选到能耐受1.5%的NaCl浓度的水稻突变体hst1。

● 2. MBS策略定位候选基因
将hst1株系和野生型Hitomebore株系杂交，F1代株系再进行自交获得F2代分离群体。对F2耐盐性个体20株混池进行基因组重测序，同时测序野生型亲本。利用Mutmap分析软件鉴别SNP-Index差异最为显著的区域，将耐盐性状定位到6号染色体上2.76Mb-8.57Mb区间。在该候选区间内，OsRR22基因发生了终止突变，编码色氨酸TGG突变成终止子TAG，可能是导致耐盐性状的候选基因。

● 3. 候选基因的验证
在Tos17转座子插入突变库中筛选OsRR22基因的等位基因突变体（NE0017和NF6804），NF6804突变株自交纯合子代、hst1和NE0017杂交F1代株系同样具有盐度耐受。

● 4. hst1表型验证
通过表型观察和转录组测序，发现突变体hst1产量、品质、株高、花序数及大小都与Hitomebore株系无差异。

● 5. 耐盐品种Kaijin的培育
从实际应用角度考虑，以耐盐突变体hst1与Hitomebore株系杂交，最终培育出耐盐品种Kaijin，该品种既有突变体hst1的高耐盐性，又保留了Hitomebore株系的优良性状。整个新品种培育过程只需两年时间。

案例二：数量性状定位：QTL-SEQ进行鹰嘴豆粒重主效基因定位

研究背景：

　　鹰嘴豆是重要的粮食作物，提高其总产量、单产量具有重要的经济与社会价值。鹰嘴豆的百粒重常被视为衡量其单产量的一个重要性状，但决定百粒重的QTL基因尚未经充分报道。传统QTL定位主要采用基于分子标记的图位克隆，费时费力，特别是对于分子标记数量有限的鹰嘴豆实现QTL的精细定位更为困难。

研究内容：

　　本研究对鹰嘴豆粒重差异明显的两个亲本杂交所产生的F4代分离群体，分别对分离群体的粒重极端个体混合成池，与杂交亲本同时进行基因组重测序。采用QTLseq分析方法，筛选与粒重性状相关的基因组区域，在1号染色体上定位一个主效QTL（CaqSW1.1），并结合传统的QTL定位方式将该主效QTL区间缩小到包含6个基因的35Kb范围内。对这6个基因的RT-PCR定量显示，其中的CSN8基因在种子中特异性表达，并且表达量在两个极端池中存在差异。

研究结果：

● 1. QTL-seq定位：低粒重与高粒重亲本杂交，单粒传获得F4代分离群体，测定百粒重，根据性状的分布，选择粒重最低和最高的10株，分别混合成池进行基因组重测序，同时测序杂交的两个亲本。结合QTLseq分析方法，计算两个极端池间的Δ(SNP-index)，在1号染色体前端定位到一个区间大小约为35Kb的主效QTL，该区间共包含6个基因。

● 2. 传统QTL定位验证：基于传统的QLT定位，利用1号染色体上95个多态性标记同样将粒重的主效QTL定位在1号染色体相同位置。与传统QTL定位结果相比，QTLseq定位结果更为精确（1.8cM vs 0.6cM）。

● 3. 候选区间基因功能验证：通过RT-PCR对6个候选基因分别在粒重高、低植株的叶片和种子中进行基因表达量的测定，结果显示， CSN8基因在种子中特异性表达，并且在高粒重的植株中表达量显著上升。

参考文献

[1] Takagi H, Tamiru M, Abe A , et al. MutMap accelerat es breeding of a salt-tolerant rice cult ivar. Nat Biotech. 33,445-449 (2015). (IF: 41.514)
[2] Das S, U padhyaya HD, Bajaj D, et al. Deploying QTLseq for rapid delineation o f a pot ential candidate gene underlying major t rait-associated QTL in chickpea. DNA Res. 22, 193-203 (2015). (IF: 5.267)