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蛋白芯片样品处理方法及用量建议

    蛋白芯片作为研究蛋白组学的热门工具之一,广受各科研工作者的喜爱,但是拥有优秀的研究工具还不够,要获得更加完美的实验结果,首先应该拥有一份质量很好的样本,这样才能使科研无往不利。接下来我们与大家分享什么类型样本适合做蛋白芯片以及常见的各类样品的处理方法,帮助大家解决样品处理的疑问。


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适用于蛋白质芯片的常见样品

血清、血浆、细胞培养上清、细胞裂解液、组织裂解液;除了这些常见的样品,全世界客户使用RayBiotech芯片检测成功的特殊样品还有尿液、眼泪、唾液、痰、脑脊液、前列腺液、腹腔注射液、奶水、初乳、支气管肺泡灌洗液、脓肿液、中耳液、血小板释放物、骨头裂解液、精浆液、卵泡液、囊泡液等。



样品收集方法


1、血清

收集全血至普通离心管或者采血管(BD vacutainer公司的红头真空采血管,不含抗凝剂、防腐剂或者分离剂),室温放置30- 45 min,以3000- 5000 rpm/min离心10 min,取上清检测或者冻存(- 80℃)。



2、血浆

收集全血至BD vacutainer公司的EDTAK2、肝素锂、或者枸橼酸钠等真空采血管,以3000- 5000 rpm/mL离心10 min,取上清检测或者冻存( - 80℃)。



3、尿液

收集不添加稳定剂的尿液样本,高速离心样本(如10000 g离心1 min或5000 g 离心2 min),取上清分装,利用干冰或甲醇浴使样本迅速结冻,储存于- 80℃备用。



4、细胞上清

血清中含有部分细胞因子,所以建议制备无血清或低血清条件培养基。例如,于培养皿或培养板中加入完全培养基,接种细胞;细胞贴壁后,加入含药物的6- 8 ml无血清或低血清(低于2%胎牛血清)培养基作用细胞;待药物作用时间点到达时,确保细胞数目足够多(数量约为106 – 107 ),收集培养上清于15ml离心管中,2000rpm、4℃离心10min,收集上清,分装于1.5 mL EP管,储存于- 80℃中。


细胞上清归一化方法:

对于细胞上清的检测,不同组之间需要接种同样数量的细胞、加入同样体积培养基,培养同样时间后收集样品。



5、细胞裂解液

待药物作用时间点到达时,确保细胞融合度达到90%以上(数量约为106 – 107 ), 将上清吸掉,用PBS (4℃)清洗2次细胞,加入150-200μl细胞裂解液(或者参照您购买的裂解液说明书),快速将细胞从培养板刮下 ,收集细胞裂解液,加入微量离心管中,冰浴30min,期间每10min使用涡旋器涡旋30s。或者吸弃上清,用PBS洗涤细胞2次后,加入PBS刮落细胞,收集于离心管中,2000- 3000rpm 4℃离心10min,弃上清。加入100-150μl细胞裂解液,冰浴30min,期间每10min使用涡旋器涡旋30s。14000rpm 4℃离心混合液10min,吸取清澈上清于干净的离心管中(确保只吸取上层清澈细胞上清,如果上清出现絮状或者浑浊,将细胞裂解液上清转入干净的离心管中,于14000 rpm4℃再次离心15 - 20 min 后取上清)。建议裂解蛋白浓度至少2 mg/ml以上,上样时稀释倍数约5- 10倍,上样浓度建议为500ug/ ml。


6、细胞

待药物作用时间点到达时,确保细胞量足够多,将上清吸掉,用PBS (4℃)清洗2次细胞,加入PBS刮落细胞,收集于离心管中,2000- 3000rpm 4℃离心10min,弃上清, 分装于1.5 mL EP管,储存于- 80℃



7、组织裂解液

将组织切成小块,转移至2 ml离心管,建议20 mg - 100 mg 组织加入500μl裂解液(或者参照您购买的裂解液说明书),使用研浆机将组织打碎,冰浴14000 rpm 4℃离心混合液15- 20 min,将清澈上清转入干净的离心管中(确保只吸取顶层清澈上清,如果上清出或者吸现絮状或者浑浊,将上清转入干净的离心管中,14000rpm 4℃再次离心15- 20 min后取上清)。



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样品裂解方法


1、组织裂解步骤

一 裂解液的配制

1 将2X Cell Lysis Buffer稀释2倍备用,用蒸馏水或者双蒸水稀释。

2 配制Protease Inhibitor Cocktail:将Protease Inhibitor Cocktail(蛋白酶抑制剂)小管简单离心,然后将盖子打开,加入60ul稀释好的1X Cell Lysis Buffer在小管中,混匀溶解蛋白酶抑制剂。

3 取20ul配制好的蛋白酶抑制剂,加入到1980ul的1X Cell Lysis Buffer中,混匀,即配制好的已添加蛋白抑制剂的细胞/ 组织裂解液,备用。

注:蛋白酶抑制剂可以使用商业化的蛋白酶抑制剂,按照说明书配制即可;

    或者使用2M PMSF蛋白酶抑制剂: 取6.968 g PMSF溶解在200 ml 酒精(100%),然后稀释400倍使用。

二 组织裂解

4   将配制好的细胞/ 组织裂解液和1X PBS 在冰上预冷;

5   从-80度冰箱取出冰冻组织,取100 mg组织,用手术剪刀将其剪碎至1-3 mm3,转移至2ml离心管,加入200ul细胞裂解液,置冰上保持低温,匀浆机裂解组织,30s--5min(根据具体组织而定)。

6   冷冻离心机离心14000rpm 10min;

7   取上清,分装后在-80度冻存,避免反复冻融;

8   干冰邮寄

注:采用蛋白定量试剂盒定量制备的组织裂解液,蛋白浓度至少大于5mg/ml。




2、细胞裂解步骤

1 将2X Cell Lysis Buffer稀释2倍备用,用蒸馏水或者双蒸水稀释。

2 配制Protease Inhibitor Cocktail:将Protease Inhibitor Cocktail(蛋白酶抑制剂)小管简单离心,然后将盖子打开,加入60ul稀释好的1X Cell Lysis Buffer在小管中,混匀溶解蛋白酶抑制剂。

3 取20ul配制好的蛋白酶抑制剂,加入到1980ul的1X Cell Lysis Buffer中,混匀,即配制好的已添加蛋白抑制剂的细胞裂解液,备用。

4   将配制好的2ml细胞裂解液和1X PBS 在冰上预冷;

5   将细胞板放在冰上进行细胞裂解;

6   用1xPBS将细胞清洗3次,弃去1X PBS,最后一次要彻底吸干1X PBS;

7   加入100-200ul裂解液,然后将细胞刮下来,收集到EP管中;

8   将EP管在冰上放置30min,每隔5-10min涡旋摇匀30s;

9   冷冻离心机离心14000rpm 10min;

10   取上清,分装后在-80度冻存,避免反复冻融;

11   干冰邮寄

PS:   也可以将悬浮细胞离心收集细胞沉淀,然后加适量裂解液进行裂解;

注:蛋白酶抑制剂可以使用商业化的蛋白酶抑制剂,按照说明书配制即可;

    或者使用2M PMSF蛋白酶抑制剂: 取6.968 g PMSF溶解在200 ml 酒精(100%),然后稀释400倍使用。

     采用蛋白定量试剂盒定量制备的细胞裂解液,蛋白浓度至少大于5mg/ml。



样本用量需求表


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文章分类: 蛋白芯片样本库