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1 血清血浆样本 血浆 Plasma 样本的收集和储存： •收集全血到市售的抗凝剂处理采集管内(经 EDTA，柠檬酸或肝素处理)，上下颠倒混匀10次; •在制冷离心机中以 4℃，2000 x g 离心 10 分钟，以去除血浆中的细胞； •立即将血浆转移到干净的冻存管中； •储存在-80 ℃. 血清Serum 样本的收集和储存： •收集全血到血清采集试管中； •让血液在室温下凝固，这通常需要 15-30 分钟。注意：在放置超过60 分钟的样品中，凝结的细胞有可能开始溶解； •在制冷离心机中以 4℃，2000 x g 离心 10 分钟，以去除血块； •立即将血清转移到干净的冻存管中； •储存在-80 ℃。 注意事项： •任何指定用于采集血清或血浆的市售采集管均可。请确保所有样本的采集方式和采集管种 类相一致（同一品牌、同一规格等）。 •用耐温标签或记号笔标注样本信息，并做好记录。 •NULISA 检测每个 panel 需要用到 25ul 样本，请按检测需求分样，避免反复冻融，建议单管分装至少 50ul。 •对于小鼠样本检测至少需要12.5ul血浆或血清，另加入12.5ul 样本稀释液（801041 Alamar），或者25ul未稀释血浆或血清，建议单管分装至少15ul。 •离心后血浆或血清样本如果明显浑浊，请再次离心确保样本澄清。 •如需运输样本，务必确保运输过程中干冰足量，密封包装，避免样本融化。 2 脑脊液样本 脑脊液样本的收集和储存： •将腰椎穿刺或者其它方法收集的脑脊液收集于无菌试管中； •在制冷离心机中以4℃，1000 x g 离心10分钟，除去脑脊液中的细胞； •立即取上清液转移至干净的冻存管中并分装； •储存在-80℃冰箱。 注意事项： •NULISA检测每个panel需要用到25ul样本，请按检测需求分样，避免反复冻融，建议单管分装至少50ul。 •离心后脑脊液如果明显浑浊，请再次离心确保样本澄清。 •如需运输样本，务必确保运输过程中干冰足量，密封包装，避免样本融化。 3 脑组织样本 脑组织样本的收集和储存（推荐使用盐酸胍GHCL 方法提取脑组织蛋白）： • 配置GHCL 提取液：用 Tris-Cl 缓冲液（20 mM Tris-HCl、150 mMNaCl、pH 7.4）中制 备新鲜的 5M 盐酸胍(GHCL)，并置于冰上。加入 1:100 蛋白酶抑制剂 混合物（cOmplete™, Mini, EDTA-freeProtease Inhibitor Cocktail，Sigma Aldrich）和 1:100 磷酸酶抑制剂混合物 2 和 3（Phosphatase inhibitor cocktail 2 and 3, SigmaAldrich） • 按 5:1 的比例将 GHCL 提取液添加到脑组织中（5M GHCL 提取液以毫升(ml)为单位：脑 组织湿重以克(g)为单位） • 使用 TissueLyser LT (Qiagen) 组织研磨仪以 50 Hz 频率匀浆 5 分钟 • 将脑组织匀浆放在摇床上，室温裂解 1 小时 • 以17,000g 室温离心 15 分钟，收集脑组织匀浆上清液 • 使用 BCA 检测法定量脑组织匀浆上清液总蛋白浓度 • NULISAseq 检测的推荐脑组织样本总蛋白浓度范围为 0.01-0.2mg/ml；**稀释度应根据客户经验确定 • 将脑组织匀浆上清液转移分装至干净的冻存管中 • 将样本储存在-80℃冰箱 注意事项： • NULISA 检测每个panel 需要用到25ul 样本，请按检测需求分样，避免反复冻融，建议单管分装至少50ul。 • 离心后脑组织匀浆上清液如果明显浑浊，请再次离心确保样本澄清。 • 如需运输样本，务必确保运输过程中干冰足量，密封包装，避免样本融化。 4 唾液样本 唾液Saliva样本的收集和储存（适用于6岁以上受试者）： 1. 采集前，应告知患者以下注意事项： o 采集样本前至少60分钟避免进食正餐。 o 采集样本前即刻避免食用高糖、高酸或高咖啡因含量的食物。 o 若患者未遵循上述指示且需采集样本，则让患者用清水漱口以去除食物残渣。 漱口后至少等待10分钟再采集样本，以免样本被稀释。 o 过去12小时内摄入酒精/咖啡因、使用尼古丁及服用处方药/非处方药的情况可 能会影响唾液分泌，应予以记录。 2. 采集时，为每位患者准备一支50毫升锥形采集管并贴上标签。 3. 通过被动滴流法在50毫升锥形管中采集2毫升非刺激性唾液。 o 被动滴流采集步骤：让患者身体前倾，不要吞咽，让唾液在舌下和口腔前庭处 积聚。唾液积聚后，将唾液推入打开的锥形管中。**样本采集量为2毫升唾液；1毫升也可接受。采集时间应为3-5分钟。 4. 将样本置于冰上储存，直至可进行处理。 5. 以300g的离心力对唾液样本离心5分钟。 o 若样本粘稠，细胞可能无法形成沉淀。若未形成沉淀，可提高离心速度，重新离心样本。 6. 将唾液样本的上清液转移至已贴标签的试管中，注意不要搅动细胞沉淀，分装 冻存至-80℃冰箱。 注意事项： • NULISA检测每个panel需要用到25ul样本，请按检测需求分样，避免反复冻融，建议单管分装至少50ul。 • 用耐温标签或记号笔标注样本信息，并做好记录。 • 离心后唾液样本如果明显浑浊，请再次离心确保样本澄清。 • 如需长途运输样本，务必确保运输过程中干冰足量，密封包装，避免样本融化。 5 尿液样本 尿液Urine样本的收集和储存： NULISA检测推荐使用晨尿，主要有两个原因:1) 早上的**次尿液通常浓度更集中；2) 这确保了尿液样本是在相似的时间点采集的。 收集的尿液样本在400g下离心10分钟以去除不溶物质。 样品应分管冷冻保存，**在-80°C，但根据研究对象，可接受在4°C的较短时间内(<6h) 保存 注意事项： •NULISA检测每个panel需要用到25ul样本，请按检测需求分样，避免反复冻融，建议单管分装至少50ul。 •用耐温标签或记号笔标注样本信息，并做好记录。 •离心后尿液样本如果明显浑浊，请再次离心确保样本澄清。 •如需运输样本，务必确保运输过程中干冰足量，密封包装，避免样本融化。 6 粪便样本 粪便Stool样本的收集和储存： 1. 配置新鲜RIPA提取液：在 RIPA缓冲液（Pierce VWR, 货号PI89900）中按照1:100 比例加入蛋白酶抑制剂混合物（cOmplete™, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail，Sigma Aldrich，货号11836170001）和 1:100 磷酸酶抑制剂混合物 2 和 3（Phosphatase inhibitor cocktail 2 and 3, Sigma Aldrich，货号P5726-1ML和P0044-1ML）。 2. 按体积（毫升）与重量（克）5:1的比例，向粪便样本中加入RIPA提取液，放置摇床上，于室温下轻柔振摇1小时。 3. 以10,000g离心10分钟，收集上清液到新EP管中。 4. 重复10,000g离心10分钟，以**程度去除杂质并收集全部液体。 5. 收集上清液，分装后于-80℃保存，直至准备进行检测。 6. NULISA检测时，为避免基质效应，根据经验可进行稀释（比如不稀释，2倍稀释，5倍稀释）后检测。 注意事项： • NULISA检测每个panel需要用到25ul样本，请按检测需求分样，避免反复冻融，建议单管分装至少50ul。 • 用耐温标签或记号笔标注样本信息，并做好记录。 • 离心后粪便样本如果明显浑浊，请再次离心确保样本澄清。 • 如需长途运输样本，务必确保运输过程中干冰足量，密封包装，避免样本融化。 7 房水及玻璃体液样本 房水是位于眼睛前部的一种透明液体，负责提供营养并排除眼睛中的多余 物质和废物。玻 璃体是一种无色透明的凝胶状物质，位于视网膜和晶物体之间。它主要由水、蛋白质盐糖 和胶原组成。眼内液可用于研究感染性炎症病和疾。 房水具有水样的稠度，但玻璃体是一种具有高粘度的凝胶状物质，会影响准确的移液。用于澄清玻璃体样品两种常方法是：高速离心（例如， 12000rpm，15分钟）和离心过滤器 （ 例如，来自 Millipore 0.22mm GV Durapore过滤器 ）。眼部液体按照体积标准化。不需要包括生物重复或添加蛋白酶抑制剂。当测试非标准类型样本时，可以包括技术重复，以便更好地估算 CV 。为了评估有过饱和风险的蛋白质检测， 建议对每个研究组的几样本进行两次额外稀释。 样本制备建议： 1、 应按照**实践临床指南收集眼部液体。 2、 新鲜采集的样品在室温下可短时间内稳定，如果可能应储存冰上或 4度。 3、 分装并储存在 -80 度。 4、 最少 10ul，建议不少于 20ul。 8 非脑组织样本 组织样本的收集和储存（推荐使用RIPA方法提取组织蛋白）： • 配置新鲜RIPA提取液：在 RIPA缓冲液（Pierce VWR, 货号PI89900）中按照1:100 比 例加入蛋白酶抑制剂混合物（cOmplete™, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail，Sigma Aldrich，货号11836170001）和 1:100 磷酸酶抑制剂混合物 2 和 3 （Phosphatase inhibitor cocktail 2 and 3, Sigma Aldrich，货号P5726-1ML和P0044-1ML） • 按 5:1 的比例将 RIPA提取液添加到组织样本中（RIPA提取液以毫升(ml)为单位：组织 湿重以克(g)为单位） • 使用 TissueLyser LT (Qiagen) 组织研磨仪以 50 Hz 频率匀浆 5 分钟 • 将组织匀浆放在摇床上，室温裂解 1 小时 • 以17,000g 离心 15 分钟，收集组织匀浆上清液 • 使用 BCA 检测法定量组织匀浆上清液总蛋白浓度，根据样本浓度可以用RIPA裂解液稀 释样本浓度至1mg/ml或者更低浓度。 • NULISAseq 检测的推荐组织样本总蛋白浓度范围为 0.01-0.2mg/ml；**稀释度应根 据客户经验确定 • 将组织匀浆上清液转移分装至干净的冻存管中 • 将样本储存在-80℃冰箱 注意事项： • NULISA检测每个panel需要用到25ul样本，请按检测需求分样，避免反复冻融，建议单 管分装至少50ul。 • 确保上机前实验组和对照组样本稀释到一致浓度，避免总蛋白浓度差异造成标志物水平差异。 • 离心后组织匀浆上清液如果明显浑浊，请再次离心确保样本澄清。 • 如需运输样本，务必确保运输过程中干冰足量，密封包装，避免样本融化。 本方法改编自参考文献: Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 2023, 82, 127- 139 https://doi.org/10.1093/jnen/nlac122 |
